新型吡唑乙酰胺类琥珀酸脱氢酶抑制剂的设计、合成及抑菌活性

为开发出新型杀菌剂候选分子,通过柔性改造吡唑甲酰胺杀菌剂结构中的二元酰胺键得到了一系列潜在靶向真菌琥珀酸脱氢酶(SDH)的新型吡唑乙酰胺分子.借助菌丝生长速率法发现了其中具有广谱抑菌特性的二苯醚联吡唑乙酰胺分子(6l),其在药剂质量浓度为50μg/mL时对水稻纹枯病菌、小麦赤霉病菌和草莓灰霉病菌的抑制效果均优于对照药剂噁霉灵.化合物6l对水稻纹枯病菌的半最大效应浓度(EC_(50)值)为19.92μg/mL,抑菌活性明显优于对照药剂噁霉灵和氟吡菌酰胺(EC_(50)分别为76.74和40.36μg/mL).SDH酶活力测试结果表明,真菌体内的SDH是化合物6l抑制水稻纹枯病菌生长的潜在作用靶标.分子对接研究结果显示,化合物6l分子结构中的二苯醚单元能以多种方式与靶标口袋的关键残基结合,对分子发挥抑菌活性起到了关键作用.研究结果表明,二苯醚联吡唑乙酰胺分子对植物病原真菌具有较显著的抑制作用,在其结构基础上进行深度的优化和改造有望得到可有效防控植物病原真菌的新型杀菌剂候选分子.

含吡啶盐喹唑啉酮衍生物的合成及抑菌活性

为开发出新型绿色杀菌剂候选分子,本文将杀菌剂结构中频繁出现的吡啶单元有机融入喹唑啉-4(3H)-酮骨架的3位,设计并合成了8个含吡啶盐的喹唑啉酮分子。通过^(1)H NMR、^(13)C NMR和HRMS确证结构后,采用菌丝生长速率法和浊度法分别测定了上述目标分子对植物病原真菌和细菌的抑制活性,生测结果发现部分目标分子能显著抑制水稻白叶枯病菌和柑橘溃疡病菌。其中,1-((4-氧代喹唑啉-3(4H)-基)甲基)-1-氯化吡啶盐类分子7a对柑橘溃疡病菌的EC_(50)值达到了13.03μg·mL^(-1),抑菌效果约为商品化杀菌剂噻菌铜的3倍(40.88μg·mL^(-1))。上述研究表明含吡啶盐的喹唑啉酮分子对植物病原细菌具有较显著抑制作用,在其结构基础上进行深度的优化和改造有望得到可有效防控植物病原细菌的杀菌剂候选分子。

含香豆素结构的1,4-戊二烯-3-酮类衍生物的合成及生物活性

为了开发新型抗肿瘤药物候选分子,将香豆素单元有机融入1,4-戊二烯-3-酮分子骨架中,设计合成了16个结构新颖的单羰基姜黄素衍生物.在确证目标分子结构后,采用甲基四氮唑盐(MTT)比色法测试了其对胃癌SGC7901细胞和肝癌HepG2细胞体外增殖的抑制活性.生物活性测试结果表明,绝大多数目标分子均能显著抑制SGC7901和HepG2细胞的体外增殖.其中,化合物4c和4j对SGC7901细胞的半数抑制浓度(IC_(50))为0.22和0.27μmol/L,其活性显著优于对照药剂表柔比星(1.23μmol/L).同时,化合物4l对HepG2细胞的IC_(50)值(0.47μmol/L)也显著优于表柔比星(2.30μmol/L).细胞形态学研究结果进一步证实,含香豆素结构1,4-戊二烯-3-酮衍生物能显著抑制多种肿瘤细胞的体外增殖,可作为高效抗肿瘤药物候选分子进行深度开发.

苦参抗水产病原哈氏弧菌活性物质的提取、鉴定及作用机制

利用单因素实验、Box-Behnken试验设计结合响应面分析法,从提取溶剂(蒸馏水、50%甲醇、甲醇、50%乙醇、乙醇)、乙醇浓度(60%~100%)、提取温度(60℃、70℃、80℃、90℃、100℃)、提取时间(60 min、90 min、120 min、150 min、180 min)和液料比等对抑菌活性的影响几方面优化苦参抗水产病原哈氏弧菌(Vibrio harveyi)活性物质(ASSF)的提取工艺;采用高效液相色谱和标准品比对技术,鉴定ASSF的抗菌活性化合物;从对哈氏弧菌的生长、细胞膜的完整性和通透性、细胞壁的通透性等方面探讨ASSF的作用机理。结果表明:ASSF的最佳提取条件是:无水乙醇为溶剂,液料比30∶1 mL/g,提取温度79℃,提取146 min。在此条件下,提取物抑菌圈的实际值为(17.64±0.22)mm,与预测值无显著性差异。固态ASSF的得率为(21.17±0.91)%。鉴定出苦参酮是ASSF中的抗哈氏弧菌活性化合物。ASSF和苦参酮的最小抑菌浓度分别为0.125 mg/mL和0.0625 mg/mL。ASSF对于哈维氏弧菌的抑制作用主要是通过破坏细胞膜的完整性和通透性、细胞壁的通透性抑制细胞的增殖。本研究结果可为进一步开发苦参酮在水产病害防治中的应用提供依据。

大黄素-香豆素噻唑类衍生物的合成及其抗哈氏弧菌活性

以大黄素为先导化合物,根据活性基团拼接原理,将具有良好抗菌活性的香豆素噻唑和大黄素通过酰胺键连接到同一分子上,设计并合成了6个含有香豆素噻唑的大黄素酰胺类衍生物(8a~8f),并对其抗菌活性进行了评价。结果表明:化合物8b、8c和8f对哈氏弧菌活性存在不同程度的抑制作用,抑菌圈分别为13.37±0.07 mm、13.60±0.12 mm和13.54±0.09 mm,MIC均为0.25 mg/mL。所有化合物的结构经IR、1H NMR以及HR-MS(ESI)确证。

论他汀类药物代谢基因SLCO1B1 521 T>C 位点多态性的新型高灵敏度检测方法的建立

建立检测一种新型的SLCO1B1基因521位点高灵敏度检测方法。方法 本研究将重组酶聚合酶扩增(RPA)和连接酶检测反应(LDR)与qPCR技术相结合,建立了一种新型高灵敏度检测技术,并对其中关键步骤LDR进行了体系优化,比较本研究所建立的方法与荧光探针PCR方法检测结果是否一致。结果 将本方法用于临床样本SLCO1B1基因521位点多态性检测。9例样本检测结果与临床荧光探针法分型结果完全一致。结论 本研究所建立的研究方灵敏度高,检测极限低至1拷贝/μL,在精准医学相关的基因分型检测方面有潜在的应用前景。

表观遗传修饰剂诱导海洋来源Penicillium minioluteum ZZ1657次级代谢产物的研究

目的对添加了组蛋白去乙酰化酶抑制剂vorinostat或丁酸钠的海洋来源朱黄青霉菌Penicillium minioluteum ZZ1657的次级代谢产物进行研究。方法采用传统色谱方法(如薄层色谱、硅胶柱色谱、凝胶层析过滤)结合现代色谱法(如高效液相色谱),对菌株发酵产物的乙酸乙酯萃取物进行纯化;采用核磁共振波谱(NMR)、高分辨质谱(HRMS)等现代谱学技术,结合文献数据鉴定分离的化合物结构;采用CCK-8法和96孔板法评价化合物的抗癌和抗菌活性。结果从刺激后的朱黄青霉菌ZZ1657的发酵物中共计分离出6个化合物,鉴定为酪醇(1)、对羟基苯甲酸(2)、2,4-dihydroxy-6-(4-hydroxy-2-oxopentyl)-3-methylbenzaldehyde(3)、orcinol(4)、苔色酸(5)、purpuresters A(6)。结论表观遗传修饰剂vorinostat或丁酸钠能够调控菌株Penicillium minioluteum ZZ1657的次级代谢产物表达能力,增加其产物的多样性。化合物1~5为首次从该菌株中分离得到。活性测试表明,6个化合物均无抗癌和抗菌活性。

副溶血弧菌重组酶聚合酶扩增快速检测方法的建立及初步应用

为建立副溶血弧菌快速检测方法,本研究以副溶血弧菌不耐热溶血素(tlh)基因作为靶序列设计特异性引物,经反应条件优化建立了检测副溶血弧菌的重组酶聚合酶扩增(RPA)方法。优化试验结果显示该方法在37℃和35 min条件下检测效果最佳;特异性试验结果显示,该方法除对副溶血弧菌的检测结果为阳性外,对其余8种常见的弧菌检测结果均为阴性,特异性较强;敏感性试验结果显示,该RPA方法对副溶血弧菌的检出限为104cfu/mL,敏感性较高。利用建立的RPA检测方法、培养法及普通PCR方法同时对采集的48份海鲜样品进行检测,结果显示:该RPA方法能够对临床样品快速检测,并且检测结果与国家标准培养法及普通PCR方法的符合率为100%,能够满足临床样品的检测需求。本研究建立了一种检测副溶血弧菌的方法,该方法具有反应快速、特异性强、敏感性高等特点,为副溶血弧菌的快速检测奠定基础。

杀鲑气单胞菌可视化重组酶聚合酶扩增检测技术的建立

本研究根据杀鲑气单胞菌(Aeromonas salmonicida)的铁载受体(fstA)基因的保守序列设计特异性引物和探针,建立了一种基于重组酶聚合酶扩增(recombinase polymerase amplification,RPA)与侧向流试纸条(lateral flow strips,LFS)相结合的可视化快速检测杀鲑气单胞菌的方法。结果显示:本研究建立的基于RPA-LFS的杀鲑气单胞菌检测方法在37℃孵育25 min即可完成,特异性良好,与其他致病菌无交叉反应;灵敏度实验结果显示,该菌的纯培养物和人工污染的鲤鱼组织中的最低检测限均为单次反应1 CFU(colony forming unit)。本研究建立的基于RPA-LFS的杀鲑气单胞菌检测方法具有特异、灵敏、快速等优点,检测结果可通过肉眼直接观察,操作简单,不依赖昂贵的仪器设备,适用于养殖业中杀鲑气单胞菌的现场检测。

基于氨基酸代谢组学探讨HER2阳性乳腺癌曲妥珠单抗耐药生物标志物的价值分析

目的探讨人类表皮生长因子受体2(HER2)阳性乳腺癌曲妥珠单抗耐药细胞的氨基酸图谱,筛选诊断曲妥珠单抗耐药的潜在生物标志物。方法采用超高效液相色谱串联质谱(UHPLC-MS/MS)的靶向代谢组学方法检测HER2阳性乳腺癌曲妥珠单抗敏感细胞(BT474、SK-BR-3)和曲妥珠单抗耐药细胞(HCC1954、JIMT-1)的32种氨基酸水平。利用正交偏最小二乘判别分析观察各细胞的氨基酸表达差异,以P<0.05、差异倍数(FC)>1.5或FC<0.67代表上调或下调为标准筛选差异氨基酸。通过支持向量机(SVM)诊断模型分析预测细胞的曲妥珠单抗耐药情况并采用受试者工作特征曲线(ROC)分析判断差异氨基酸的诊断价值。结果通过UHPLC-MS/MS技术共检测出32种氨基酸,根据筛选标准筛选出14种差异氨基酸,其中在曲妥珠单抗耐药细胞中犬尿氨酸、脯氨酸、苏氨酸和丙氨酸水平较曲妥珠单抗敏感组上升,而胱氨酸、精氨酸、天冬酰胺、甘氨酸、γ-氨基丁酸、半胱氨酸、N-乙酰-L-半胱氨酸、N-乙酰-L-天门冬氨酸、Nα-乙酰-L-赖氨酸和N-乙酰-L-谷氨酰胺共10种氨基酸水平较曲妥珠单抗敏感细胞下降,差异均有统计学意义(P<0.05)。联合14种差异氨基酸建立SVM耐药诊断模型,其ROC曲线下面积为1.000。结论在HER2阳性乳腺癌细胞中,氨基酸呈现不同程度的差异表达,联合犬尿氨酸、胱氨酸和脯氨酸等14种氨基酸分析在辅助诊断HER2阳性乳腺癌曲妥珠单抗耐药中可能具有一定潜在价值。

基于非靶向代谢组学的促乳腺癌曲妥珠单抗耐药代谢产物分析

目的:探究人类表皮生长因子受体2(HER2)阳性乳腺癌曲妥珠单抗(trastuzumab)耐药细胞(HCC1954)和敏感细胞(SK-BR-3)之间的代谢物差异。方法:利用超高效液相色谱-串联质谱(UHPLC-MS/MS)非靶向代谢组学方法进行代谢物的鉴定与定量,结合多元统计方法主成分分析(PCA)和正交偏最小二乘-判别分析(OPLS-DA)以筛选差异代谢物,并对差异代谢物进行KEGG通路富集分析。结果:在正负离子模式下鉴定筛选出15种显著性变化差异代谢物,在曲妥珠单抗耐药细胞中丙酰肉碱和谷胱甘肽等7种代谢物上调,肉豆蔻酸和D-葡萄糖酸等8种代谢物下调。KEGG通路富集分析发现,9条代谢通路具有统计学意义(P<0.05),其中氮代谢和谷氨酰胺与谷氨酸代谢最为显著,P值为0.0013,还发现谷氨酸和谷氨酰胺均在这两条通路中发挥作用。结论:本研究初步揭示了HER2阳性乳腺癌曲妥珠单抗耐药和敏感细胞之间的代谢物差异,为HER2阳性乳腺癌细胞曲妥珠单抗诊断标志物进一步研究提供了代谢组学的数据支持。

具有抗植物病原微生物活性的喹唑啉酮类化合物研究进展

喹唑啉酮结构单元广泛存在于多种具有药用价值的植物和微生物的次生代谢产物中,是一类在药物创制工作中具有重要开发应用价值的含氮分子骨架。喹唑啉酮类化合物展现出的较好环境兼容性、较强结构可塑性和独特生理活性,极大地启迪了人们对具有农药应用价值的喹唑啉酮类活性分子的探寻。按照生物防治对象的不同综述了近年来具有抗植物病原微生物活性的喹唑啉酮类化合物的研究进展,并对这些具有抗植物病原微生物活性的喹唑啉酮分子结构进行了归纳总结,以期能为新型绿色农药的创制有效助力。

MORF4L1蛋白抗体制备及生物信息学分析

[目的]构建MORF4L1原核表达载体和纯化表达产物,制备MORF4L1蛋白抗体并进行生物信息学分析。[方法]利用PCR将MORF4L1基因片段酶切、克隆、转化至大肠杆菌Bl21(DE3),经IPTG诱导表达蛋白。利用His-Tag技术纯化重组蛋白,用重组蛋白免疫新西兰白兔,采集抗血清后通过硫酸铵沉淀法将多克隆抗体从抗血清中纯化,应用Western Blotting验证多克隆抗体与内外源性MORF4L1蛋白的结合特异性。利用在线软件(GEPIA、UALCAN)进行生物信息学分析。[结果]成功构建了重组蛋白,蛋白纯化后在相对分子质量(Mr)43000位置处有单一条带,重组His-MORF4L1蛋白与His抗体发生特异性结合。制备的抗血清与MORF4L1蛋白特异性结合,纯化后仅在相对分子质量(Mr)55000和25000位置处有条带。纯化的多克隆抗体与内外源性MORF4L1蛋白发生特异性反应。MORF4L1的表达与肝癌不良预后相关。[结论]成功构建MORF4L1蛋白及抗体,MORF4L1在肝癌中高表达预后差,对进一步研究MORF4L1蛋白的结构和生物学功能具有重要意义。

盐地碱蓬内生菌Neocamarosporium sp.ZLM-26次级代谢产物

本研究对盐地碱蓬内生菌Neocamarosporium sp.ZLM-26的活性次级代谢产物进行了挖掘。采用薄层色谱、硅胶柱色谱、高效液相色谱等分离方法,从该菌株大米培养基发酵产物的乙酸乙酯萃取物中分离得到6个单体化合物,经波谱学解析和文献数据对比,鉴定6个化合物分别为:5-butyl-6-(hydroxymethyl)-2H-pyran-2-one(1)、(7S)-xylariolide E(2)、(6S)-xylariolide D(3)、diaporpyrone A(4)、4-hydroxybenzaldehyde(5)和2-(2-hydroxyethyl)phenol(6)。分别采用CCK-8法和96孔板法评估了6个化合物的抗肿瘤和抗菌活性。结果显示,6个化合物(50μmol/L)对胰腺癌细胞株SW1990、PANC-1的增殖无明显抑制作用;而化合物4对大肠杆菌有较好的增殖抑制活性,化合物5、6对铜绿假单胞菌有较好的增殖抑制活性。化合物1为1个新的天然产物,本研究首次报道了其核磁数据和抗菌活性。此外,化合物1–4均为首次从新凸轮孢菌属真菌中分离得到。

长链非编码TINCR介导乳腺癌化疗耐药的生物信息学分析

目的探讨长链非编码RNA-TINCR在耐药性乳腺癌中的表达、生物学功能、相关信号通路及其与患者预后的关系。方法利用GEPIA在线数据库比较人乳腺癌组织和正常组织中TINCR基因的mRNA的相对表达水平,通过qPCR方法验证敏感、耐药乳腺癌细胞中TINCR的表达量,借助Kaplan-Meier ploter在线数据库分析TINCR表达量高低与乳腺癌患者生存预后的关系。采用CCK8法检测改变TINCR表达量对肿瘤细胞化疗敏感性的改变,Metascape在线数据库预测TINCR的相互作用蛋白,借助DAVID对相关基因功能进行GO和KEGG信号通路功能富集分析。最后初步探讨耐药细胞中异常表达的TINCR是如何产生的。结果TINCR在乳腺癌组织及耐药乳腺癌细胞中高表达,升高TINCR表达水平可促进乳腺癌细胞对化疗药物的耐药,分析出TINCR相互作用蛋白有150个,这些蛋白调控蛋白质翻译、mRNA和rRNA的加工、mRNA的出核转运、核糖体小亚基的形成等生物学过程,信号通路富集结果主要分布在核糖体、冠状病毒疾病、剪切体、核质运输、mRNA监测通路等方面。TINCR启动子区具有ERα结合,且使用ERα抑制剂可显著抑制TINCR表达量。结论TINCR在耐药乳腺癌细胞中呈高表达水平,与患者的预后不良有关,对乳腺癌化疗耐药的预测具有重要意义。