miR-199a-5p在肝脏组织中的表达及其作用的初步研究

目的:探究不同营养状态下miR-199a-5p在肝脏中的表达水平,以及其对肝细胞甘油三酯(triglyceride,TAG)含量的影响及其潜在机制。方法:RT-qPCR检测高脂饮食小鼠肝脏组织中miR-199a-5p的表达;分别使用miR-199a-5p模拟物、抑制剂、阴性对照和pcDH-CD36-flag质粒转染Hepa1-6和AML12细胞,通过RT-qPCR和Western blot检测脂代谢相关标志物表达变化,采用试剂盒检测TAG含量;通过miRDB(microRNA Target Prediction Database)预测miR-199a-5p的靶基因并通过双荧光素酶报告实验进行验证。结果:高脂饮食和饥饿状态下C57BL/6J小鼠肝脏中miR-199a-5p的表达水平升高;过表达miR-199a-5p能够降低肝细胞内TAG,而miR-199a-5p抑制剂会增加细胞内TAG含量;miR-199a-5p通过作用于脂肪酸转位酶CD36基因的3′非翻译区(3′untranslated region,3′UTR)降低其蛋白表达。结论:在肝脏脂质积累过程中,miR-199a-5p的表达水平增加,并且miR-199a-5p可能通过靶向CD36降低肝细胞内TAG含量。

应用聚合酶链反应技术构建人血小板反应素1基因第13外显子编码钙结合域突变体

目的:利用聚合酶链反应定点突变技术构建人血小板反应素1基因第13外显子编码钙结合域突变体。方法:实验于2005-03/06在南京医科大学第一附属医院心血管病研究所完成。选择南京医科大学第一附属医院体检中心健康体检者血标本提取人基因组DNA,设计、合成两对引物,将突变位点设计在引物内,突变位点包含限制性内切酶BseNI酶切位点,采用聚合酶链式反应定点突变技术,应用高保真TaqDNA聚合酶,通过三轮聚合酶链扩增反应对血小板反应素1基因的第13外显子进行扩增,将第13外显子碱基8831A置换为G,对最终扩增产物进行酶切鉴定和测序。结果:获得人血小板反应素1第13外显子编码钙结合域突变体,经酶切鉴定和测序分析,除引入突变点产生预期A8831→G突变外,其余碱基序列无改变。结论:采用聚合酶链反应体外定点突变技术,成功构建人血小板反应素1基因第13外显子编码钙结合域突变体,为研究血小板反应素1基因该位点突变导致血小板反应素1蛋白的结构、功能变化奠定了基础。

脂肪组织中自噬影响肥胖发病机制的研究进展

肥胖是由于脂肪细胞体积增大和数量增生而引起的脂肪组织异常或过度堆积导致的一种慢性代谢性疾病,由环境因素和遗传因素共同决定。近年来,自噬在调控脂肪细胞数量、脂肪生成和白色脂肪棕色化等过程中的作用引起了广泛关注。文章就脂肪组织中3种不同类型的自噬对脂肪生成、白色脂肪棕色化和脂肪代谢等过程的影响进行系统性总结回顾,旨在阐明自噬对脂肪组织功能及肥胖的影响,进而为肥胖的预防和治疗提供潜在靶点。

棕榈酰化转移酶9调控非小细胞肺癌增殖、迁移、侵袭及相关机制研究

目的:探讨棕榈酰化转移酶9(zinc finger DHHC-type containing 9,ZDHHC9)在非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC)中的表达及预后,及ZDHHC9对NSCLC细胞增殖、迁移和侵袭能力的影响及作用机制。方法:通过NCBI GEC数据库和基于基因表达水平值的交互式分析平台(gene expression profiling interactive analysis,GEPIA)数据库分析ZDHHC9在NSCLC中的表达及其与患者预后之间的关系。利用实时定量PCR(Real-time qPCR)检测正常支气管上皮细胞系(16HBE)及NSCLC细胞系(A549、H1299、H1703)的表达情况。在H1703和A549细胞系中敲降ZDHHC9,利用CCK-8实验检测细胞增殖能力,Transwell和划痕实验检测细胞迁移、侵袭能力,Western blot检测相关蛋白水平变化。结果:GEO和GEPIA数据库生物信息技术分析结果显示,ZDHHC9在NSCLC组织中较癌旁组织显著升高,并且ZDHHC9表达量与患者的无病生存率相关(P<0.01)。敲降ZDHHC9后,H1703和A549细胞增殖活力显著下降,同时侵袭和迁移能力受到抑制,并且敲降ZDHHC9降低NSCLC细胞脂肪酸合成关键酶的表达水平。结论:ZDHHC9可能通过调控NSCLC细胞脂肪酸合成促进NSCLC细胞的增殖、迁移和侵袭。

VPS13A在3T3-L1脂肪细胞分化过程中的表达及调控研究

目的:明确囊泡分选蛋白13A(vacuolar protein sorting 13 homolog A,VPS13A)在小鼠胚胎成纤维细胞(mouse embry-onic fibroblast cells,3T3-L1)分化过程中的表达水平;探索VPS13A对3T3-L1细胞的影响。方法:利用Western blot及Q-PCR法检测3T3-L1细胞在分化过程中VPS13A的表达,利用CRISPR/Cas9系统构建VPS13A稳定敲降细胞系,Western blot和油红染色检测VPS13A敲降后对3T3-L1细胞分化的影响。结果:VPS13A的表达在3T3-L1分化过程的早期降低,在分化的后期升高。敲降VPS13A后,3T3-L1细胞中脂滴增多,参与调控脂肪细胞分化基因的表达水平升高。结论:在3T3-L1细胞中VPS13A的表达水平在分化过程中被调控,敲降VPS13A可以促进3T3-L1细胞的分化成熟。

TNF-α通过JNK和AP-1途径调节乳腺癌MCF-7细胞VEGF的表达

目的:探讨肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor-α,TNF-α)诱导血管内皮生长因子(vascular endothelial growth fac-tor,VEGF)表达的机制。方法:以20 ng/ml TNF-α处理MCF-7细胞,用Western blotting检测MAPK(JNK,p38,ERK)信号通路中蛋白磷酸化水平的变化以及AP-1家族(c-Jun,Jun-B,c-Fos,Fra-1,Fra-2,JunD)的蛋白表达及磷酸化水平的变化;以免疫共沉淀法检测激活后的AP-1存在形式;以RT-PCR以及Western blotting检测VEGF mRNA和蛋白表达水平;以MAPK抑制剂预处理后,检测VEGF蛋白表达水平;运用ChIP的方法验证p-c-Jun结合在VEGF启动子区。结果:TNF-α通过激活JNK信号转导通路活化AP-1;被TNF-α激活后AP-1以p-c-Jun-c-Jun和p-c-Jun-JunB同源二聚体形式存在;TNF-α通过激活转录因子AP-1促进VEGF的转录,并增强VEGF的蛋白表达水平;p-c-jun通过与VEGF启动子AP-1结合参与对VEGF转录的调控。结论:在TNF-α作用下,AP-1通过p-c-jun同源二聚体结合在VEGF启动子的AP-1结合位点上,直接对VEGF转录进行调控。

4′-甲醚-黄芩素对绒癌耐药细胞株多药耐药性的逆转作用研究

为探讨马鞭草中4′-甲醚-黄芩素对人绒癌JAR/VP16耐药细胞株的多药耐药逆转作用及可能的逆转机制,采用四甲基偶氮唑盐比色、透射电镜观察、逆转录多聚酶链反应、流式细胞术、基因芯片以及实时定量PCR等方法,检测到4'-甲醚-黄芩素对化疗药物具有协同增效作用,显著逆转耐药细胞对鬼臼乙叉甙(VP16)、甲氨蝶呤(MTX)及更生霉素(KSM)的耐药性,该药物作用后,耐药细胞超微结构呈现凋亡样改变,细胞凋亡率增高并出现明显凋亡峰.此外,耐药细胞中MDR1、MRP1、MRP2、MRP6、AHR、COMT、FGF2等耐药相关基因以及Bcl-2、BFL1、NAIP、p63等凋亡抑制基因表达降低,而Apaf-1、ASC、ATM、Bad、Bak、Bax、BimL等凋亡促进基因表达升高.上述实验结果表明:4′-甲醚-黄芩素对绒毛膜癌耐药细胞具有显著的耐药逆转作用,这种逆转作用可能是通过降低耐药基因表达、促进细胞凋亡实现的.

脱氧胆酸通过NF-κB调节人胆管癌细胞系QBC939增殖和凋亡的研究

目的:研究脱氧胆酸对人胆管癌细胞凋亡和增殖的影响;以及该影响的细胞内信号转导途径。方法:用四甲基偶氮唑蓝[3鄄(4,5鄄dimethylthiazole鄄2yl)鄄2,5鄄diphenylte鄄trazoliumbromid,MTT法]比色法和流式细胞仪技术(flowcytometry)检测脱氧胆酸对QBC939细胞增殖和凋亡的影响。用荧光素酶报道基因技术检测在脱氧胆酸作用前后核转录因子(nuclearfactorkappaB,NF鄄κB)活性的改变。再将NF鄄κB的天然抑制因子IκB转染人胆管癌细胞系QBC939,观察用IκB抑制NF鄄κB后肿瘤细胞的增殖和凋亡的情况。结果:脱氧胆酸能抑制胆管癌细胞的增殖、促进其凋亡,这一抑制作用的机制是通过抑制NF鄄κB实现的,用NF鄄κB的抑制因子IκB作用于QBC939细胞,所起的作用与脱氧胆酸相似。结论:脱氧胆酸能通过抑制NF鄄κB的活性,抑制QBC939细胞的增殖,并促进其凋亡。

重组腺相关病毒介导的TIMP-1载体的构建及鉴定

目的:构建及鉴定载入金属蛋白酶组织抑制因子1(TIMP鄄1)的重组腺相关病毒载体。方法:应用基因重组的方法构建含全长TIMP鄄1的重组腺相关病毒骨架质粒(pAAV鄄TIMP鄄1),利用磷酸钙沉淀法将腺相关病毒载体质粒共转染入HEK293细胞中,分别装配成rAAV鄄TIMP鄄1和rAAV鄄hrGFP,将rAAV鄄hrGFP转导HT1080细胞测定重组病毒的滴度,Westernblot方法检测rAAV鄄TIMP鄄1在HT1080细胞中的表达情况。结果:成功构建rAAV鄄TIMP鄄1,病毒滴度达到109TU/ml,转导细胞后,转导组TIMP鄄1的表达水平高于对照组。结论:构建的rAAV鄄TIMP鄄1,为基因修饰胰岛移植提供了新的手段。

三苯氧胺逆转过表达BCRP的JAR/VP16细胞对VP16的耐药性

目的探讨三苯氧胺(TAM)对过表达乳腺癌耐药蛋白(BCRP)的JAR/VP16细胞的逆转耐药作用。方法在人绒癌细胞株JAR和对VP16耐药的JAR/VP16细胞株中以MTT法比较单药VP16组、TAM组及两药联合组的药物毒性,并运用流式细胞术以hochest33342和PI双染观察两株细胞在加与不加TAM时的胞内荧光值强度。以RT-PCR和Western blot方法在 mRNA水平和蛋白水平观察TAM、VP16及两药联用时BCRP表达水平。结果JAR/VP16细胞株与JAR细胞相比,BCRP的表达量上调;TAM能显著增加VP16的抗肿瘤作用,与VP16单药组相比,联合用药组的细胞抑制率增加(P<0.05);TAM可下调BCRP的表达。结论BCRP的过表达可能导致了JAR/VP16细胞对VP16的耐药,而TAM可通过下调BCRP的表达及抑制BCRP的功能,从而逆转这种耐药。

Ets-1重组腺病毒的构建与活性鉴定

目的:构建小鼠成红细胞白血病病毒E26癌基因同系物1(V-Ets avian erythroblastosis virus E26 oncogene homolog1,Ets-1)重组腺病毒,并验证其对小鼠原代胰岛及胰岛β细胞系INS-1的感染活性和Ets-1蛋白表达活性。方法:以小鼠胰岛β细胞系MIN6的cDNA为模板,PCR扩增Ets-1基因的编码区序列(coding sequence,CDS)区,纯化后经限制性内切酶切割和连接反应插入到pAdTrack-CMV穿梭质粒上,构建成pAdTrack-CMV-Ets-1质粒。将该质粒与腺病毒骨架质粒pAdEasy-1在大肠杆菌BJ5183中进行同源重组,鉴定出阳性克隆。扩增并抽提阳性克隆质粒,用PacⅠ酶切线性化后转染293A细胞,经包装得到AdV-Ets-1重组腺病毒。相应对照病毒AdV-GFP由相同方法构建。腺病毒经纯化后,感染小鼠原代胰岛及INS-1细胞,并用Western blot检测Ets-1蛋白表达水平。结果:腺病毒构建成功,并具有高感染率及高蛋白表达能力。结论:成功构建了小鼠Ets-1腺病毒,为进一步研究Ets-1基因在原代胰岛中的功能提供基础。

PNPLA7在脂肪组织中的表达及调控的初步研究

目的:明确PNPLA7在小鼠不同组织及营养状态下的表达水平;探索不同因素对PNPLA7表达的调节作用。方法:利用生物信息学初步分析PNPLA7在正常组织器官及细胞系中的表达,荧光定量PCR的方法进一步验证PNPLA7在小鼠不同组织及不同营养状态下的表达情况。免疫印迹法及荧光定量PCR法检测脂肪细胞分化过程中和脂肪细胞在胰岛素及脂肪酸处理下PNPLA7表达水平的变化。结果:PNPLA7主要表达于代谢旺盛的组织或细胞中。在饥饿条件下,小鼠脂肪组织PNPLA7的表达水平比正常饮食条件下高,但小鼠饥饿后又喂食,其脂肪组织PNPLA7的表达水平又降低。脂肪细胞中PNPLA7表达在胰岛素处理时下调,油酸处理时上调。且在脂肪细胞分化过程中,PNPLA7表达前期下降,后期逐渐升高。结论:PNPLA7在脂肪组织中的表达水平较高,脂肪细胞分化过程中其表达水平先下降后升高,且受胰岛素及不饱和脂肪酸调控。

成熟SVFs细胞与Hepa1-6细胞共培养模型的建立及对肝细胞脂代谢的影响

目的:建立小鼠成熟脂肪细胞血管基质部分(stromal vascular fraction,SVF)与小鼠肝细胞(Hepa1-6)共培养模型,研究成熟脂肪细胞对肝细胞脂质堆积以及代谢的影响。方法:从小鼠皮下脂肪分离提取原代SVF细胞,经体外分化成熟后,以Transwell小室建立成熟SVF细胞和Hepa1-6细胞间接共培养48 h体系。应用逆转录-聚合酶链反应法(RT-PCR法)检测SVF细胞PPARγ和PGC-1α等分化相关基因及Hepa1-6细胞CD36、FATP2、GPAT1等脂代谢相关基因的表达。酶法检测经共培养后的Hepa1-6细胞甘油三酯水平。结果:小鼠原代SVF细胞经诱导成熟后,出现明显较大脂滴;成熟SVF细胞中PPARγ和PGC-1α等分化标志物较未分化SVF细胞显著升高;Hepa1-6细胞甘油三酯水平明显高于未共培养组;Hepa1-6细胞GPAT1、CD36基因表达水平明显升高。结论:已成功建立成熟脂肪细胞与Hepa1-6细胞Transwell共培养模型。肝细胞与成熟脂肪细胞共培养可以诱导其脂质堆积增加,该过程可能通过上调肝细胞中CD36和GPAT1的表达水平增加脂肪酸的吸收和甘油三酯的合成通路实现。

去泛素化酶YOD1调控肝脏脂代谢的初步研究

目的:探索去泛素化酶YOD1在肝脏营养代谢中发挥的作用。方法:通过Q-PCR检测高脂饮食C57BL/6小鼠、db/db小鼠肝脏中以及油酸(oleic acid,OA)处理后的Hepa1-6细胞内,YOD1的表达情况。在C57BL/6小鼠中,通过Q-PCR法检测YOD1的组织分布及不同营养状态下的表达情况。对Hepa1-6细胞中给予OA处理,通过甘油三酯试剂盒检测细胞内甘油三脂含量,并利用油红染色观察细胞内脂滴。经Q-PCR和蛋白免疫印迹法检测细胞内相关基因的m RNA及蛋白水平。结果:短期高脂饮食后,肝脏中YOD1的mRNA水平显著下降。而与对照组db/+小鼠相比,db/db小鼠肝脏中YOD1的mRNA水平无变化。但是,经OA处理后,Hepa1-6细胞内的YOD1的mRNA水平明显减少。另外,YOD1主要表达于肝脏中。小鼠禁食后,肝脏YOD1的mRNA水平显著增加,而再喂食后显著下降。此外,过表达YOD1的Hepa1-6细胞中OA诱导的脂质堆积明显减少,且SREBP-1c的剪切被抑制。结论:本研究初步发现,去泛素化酶YOD1的表达水平受营养状态调控,并通过抑制SREBP-1c的剪切影响肝细胞的脂代谢。

miR-133b在Huh7肝细胞中对糖异生的作用研究

目的探讨在不同小鼠模型肝脏中微小非编码RNA-133b(miR-133b)的表达水平及其在Huh7肝细胞中对糖异生的作用。方法利用实时荧光定量-聚合酶链反应(RT-PCR)分别检测了miR-133b在高脂饮食喂养野生型C57BL/6小鼠、饥饿24 h的野生型C57BL/6小鼠以及糖尿病动物模型db/db小鼠肝脏组织中的表达水平,并在人源肝癌细胞系Huh7肝细胞中转染miR-133b类似物(mimic)或抑制剂(inhibitor),检测细胞的葡萄糖产出量,磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶(PEPCK)和葡萄糖-6-磷酸酶(G6Pase)的信使RNA(mRNA)水平及蛋白水平,并分析其对糖异生的影响。结果miR-133b在高脂饮食喂养野生型C57BL/6小鼠肝脏组织中表达显著升高,而在饥饿24 h的野生型C57BL/6小鼠及db/db小鼠的肝脏组织中表达水平却明显下降。Huh7肝细胞中过表达miR-133b明显降低了Huh7肝细胞的糖异生水平,而抑制miR-133b表达后可以显著升高糖异生水平。结论miR-133b的表达水平与肝脏的营养状态密切相关,并可通过调节Pepck基因的表达水平调节肝细胞的糖异生。

AcMNPV肌动蛋白核定位基因的亚细胞定位

当前细胞核内肌动蛋白的功能是一个研究热点,核内存在肌动蛋白并参与细胞核内发生的许多生命活动。杆状病毒是迄今唯一报道的利用核内肌动蛋白进行复制增殖的病原微生物,为核内肌动蛋白的结构与功能的研究提供了独特的系统。有报道显示AcMNPV的ie-1,pe38,ac4,he65,ac102和ac152基因与肌动蛋白单体的核转运有关,然而关于这六个基因的亚细胞定位及其在肌动蛋白入核过程中的功能并没有深入的研究。本文首次揭示了这六个基因的亚细胞定位,IE1和AC152是全细胞分布,PE38和AC102也为核质分布,但主要分布在细胞核中,而AC4和HE65定位于细胞质。但AC102和IE1可以分别介导AC4和HE65入核。同时我们发现当使用外源强启动子OpIE2,在转染ie-1或pe38之后表达ac4和he65可以部分招募肌动蛋白单体入核,而时序性共转染这四个基因则可招募最多肌动蛋白单体入核。对肌动蛋白核定位基因在细胞中的定位分析为进一步了解杆状病毒介导肌动蛋白入核的分子机理提供支持。

筛选MDA-MB-231乳腺癌耐药细胞株两种方法的比较

目的 比较间歇刺激法和浓度梯度递增法对雌激素受体（estrogen receptor,ER）阴性的乳腺癌耐药细胞株的建立,为进一步探讨ER阴性乳腺癌可能的耐药机制.方法 采用间歇刺激法和浓度梯度递增法,用紫杉醇诱导6个月,分别建立了耐药细胞系231 TIM10和231 TAX8,并用倒置相差显微镜、MTT法、Western印迹、流式细胞术比较了两株耐药细胞的形态学变化、耐药表型、ER-α蛋白表达及紫杉醇诱导细胞G2/M期阻滞效应的改变等生物学特性.结果 间歇刺激法比浓度梯度递增法更容易诱导ER阴性的乳腺癌细胞获得耐药表型,231 TIM10耐药指数为11.9,231 TAX8耐药指数为2.3.用紫杉醇处理后,231 TIM10细胞能够抵抗100 nmol/L紫杉醇引起的G2/M期阻滞效应,231 TAX8细胞仅能够抵抗10 nmol/L紫杉醇引起的G2/M期阻滞效应.231 TIM10细胞在诱导过程中形成了两个细胞亚群,体积增大明显,细胞之间黏连更加明显.MDA-MB-231敏感细胞和两株耐药细胞均无ER-α蛋白的表达.结论 间歇刺激法更合理地模拟了临床上ER阴性乳腺癌的耐药过程,建立了可靠的细胞耐药模型,为耐药机制研究建立了基础.

丙型肝炎病毒核心蛋白通过FOXO1/PGC-1α途径上调磷酸烯醇式丙酮酸羧基酶的转录

【目的】分析丙型肝炎病毒(HCV)核心蛋白(CORE)稳定表达对磷酸烯醇式丙酮酸羧基酶(PCK1)转录水平的影响,并分析HCV CORE调控PCK1转录的分子机制,为进一步阐明HCV感染致2型糖尿病机理的探讨提供新的思路。【方法】利用反转录病毒表达系统构建稳定表达HCV CORE的Huh7-lunet-core细胞系。采用Real-time PCR和萤光素酶报告基因技术检测Huh7-lunet-core细胞系中PCK1、FOXO1以及PGC-1α转录水平变化,并结合Western blot分析FOXO1的活性变化。【结果】HCV CORE的稳定表达显著增强PCK1的转录水平,HCV CORE不影响FOXO1的转录和表达水平,但降低FOXO1的磷酸化水平,激活了FOXO1的转录活性,并增强PGC-1α的mRNA表达水平。【结论】HCV CORE在Huh7-lunet细胞中的稳定表达激活FOXO1的转录活性,并与PGC-1α协同作用,上调PCK1的转录,从而导致肝糖异生过度发生,对HCV CORE调控PCK1转录的分子机制的揭示可能为HCV感染相关的糖尿病的治疗提供新的靶点。

siRNA干扰CASK表达对INS-1细胞胰岛素分泌的影响

目的探讨小分子RNA(siRNA)干扰CASK基因表达对大鼠INS-1细胞胰岛素分泌的影响。方法用脂质体lipofectamine 2000将针对靶基因CASK合成的特异性siRNA片段转染INS-1细胞。实时定量PCR及Western blot检测CASK基因表达变化,进行有效干扰片段的筛选。放射免疫法检测钾离子刺激胰岛素分泌(KSIS)功能的改变。结果转染100nM siRNAs 48h后,INS-1细胞中CASK基因表达明显降低(P<0.01),KSIS功能显著降低(P<0.01)。结论靶向siRNA可以特异性地抑制INS-1细胞中CASK基因表达,从而抑制钾离子诱导的胰岛素分泌。