表观基因组学研究方法进展与评价

表观遗传学是指基于非基因序列改变所致基因表达水平的变化,如DNA甲基化和组蛋白修饰等;表观基因组学则是在基因组水平上对表观遗传学改变的研究。DNA甲基化已经成为表观遗传学和表观基因组学的重要研究内容,人类表观基因组计划的最终目标是绘制出人类基因组中甲基化可变位点图谱。随着研究的不断深入,各种研究方法被开发出来以满足不同类型研究的需要。文章主要介绍目前已有的表观基因组学研究方法,并对其进行简要分析和总结。

细胞凋亡反应中NOXA基因启动子发挥增强子功能调节BCL2基因表达

真核生物基因的转录受到近端启动子和远端增强子的共同调控,部分基因的启动子可兼具有增强子的活性。NOXA与BCL2分别是BCL2蛋白家族促凋亡和抗凋亡成员。本课题组前期研究发现,NOXA基因启动子与BCL2基因启动子在染色质三维空间结构上存在相互作用,且NOXA基因启动子区兼有启动子和增强子特征性的组蛋白修饰标记。为进一步探究NOXA启动子是否具有增强子活性、能否在细胞凋亡过程中作为增强子调控BCL2基因表达,本研究利用染色质构象捕获(chromosome conformation capture,3C)、实时荧光定量PCR(quantitative real-time PCR,qRT-PCR)和荧光素酶报告基因等检测技术在喜树碱诱导的MCF-7细胞凋亡模型中证实,NOXA启动子兼具增强子活性,并可通过形成染色质环结构远程调控BCL2基因表达。NOXA启动子的调控属性与凋亡信号强弱密切相关,在较弱凋亡信号刺激下(1μmol/L喜树碱处理),NOXA启动子主要发挥增强子功能;随着凋亡刺激信号的加强(10μmol/L喜树碱处理),NOXA启动子活性增强,主要调控其基因自身的表达,促进细胞凋亡。染色质免疫共沉淀(chromatin immunoprecipitation,ChIP)证实NOXA启动子区启动子活性和增强子活性的动态变化与其组蛋白修饰标志一致。本研究为进一步探讨BCL2家族成员对细胞凋亡刺激做出协同反应的机制提供了新的线索。

可能参与调节中枢神经系统病变的新的信号分子:JWA基因对HEK293细胞谷氨酸转运的影响

目的:探讨新的微管相关蛋白JWA对谷氨酸转运的调控及其机制。方法:用构建JWA高表达载体转染的HEK293细胞,建立JWA高表达模型;用反义寡核苷酸技术抑制细胞JWA表达,建立JWA低表达模型;用激光共聚焦显微镜检测细胞内Ca2+的含量,用免疫荧光和Westernblot法检测细胞内Jwa蛋白的表达水平。掺入犤3H犦-D,L-谷氨酸为标志物观察JWA基因对细胞摄取谷氨酸的影响。结果:JWA基因高表达的细胞摄取谷氨酸增加;用反义寡核苷酸关闭JWA后,谷氨酸摄取下降。佛波酯可使JWA高表达细胞和对照组未转染细胞谷氨酸转运都增加,但未转染细胞与JWA高表达细胞谷氨酸摄取增加无显著差别。佛波酯还可引起HEK293细胞内游离钙浓度一过性升高。结论:JWA编码的微管相关蛋白可通过非PKC途径增强HEK293细胞谷氨酸转运功能,增强谷氨酸介导的神经兴奋传递,参与中枢神经系统病变,因而是一种可能参与调节中枢神经系统病变的新的信号分子。而佛波酯引起的细胞谷氨酸转运功能增强可能与细胞内钙稳态的改变有关。

核因子-κB及Bcl-2基因在肝外胆管癌组织中表达及意义

目的研究核因子κB(NF-κB)及抗凋亡基因Bcl-2在肝外胆管癌组织中的表达及意义。方法应用免疫组织化学SABC法,检测NF-κB在48例肝外胆管癌组织及12例正常肝外胆管组织中的表达变化及抗凋亡基因Bcl-2的相应表达,并分析其与肝外胆管癌临床病理的关系。结果NF-κB在肝外胆管癌组织及正常胆管组织中的阳性表达率分别为75%、16.7%,两者有显著性差异(P<0.01);Bcl-2在肝外胆管癌组织及正常胆管组织中的阳性表达率分别为64.6%、8.3%,两者有显著性差异(P<0.01)。NF-κB的阳性表达在病理分级间有显著性差异(P<0.01)且与Bcl-2的阳性表达显著相关。结论NF-κB是一种与肝外胆管癌有关的癌蛋白,其与Bcl-2高度相关,表明NF-κB可能通过对下游抗凋亡基因表达的调控,参与了肝外胆管癌的抗凋亡过程,影响肝外胆管癌的发生发展。

垂体GH腺瘤GH分泌生化特征及与gsp癌基因表达相关性

目的探讨生长抑素对人垂体生长激素腺瘤生长激素(GH)分泌的效应及其与gsp癌基因的表达相关性。方法收集20例GH腺瘤患者体内注射长效生长抑素(SST)后GH和胰岛素样生长因子-1(IGF-1)的变化,术中切除肿瘤组织进行体外细胞培养后分为SST组和对照组,应用酶联免疫吸附试验(ELISA)检测药物干预后GH的分泌变化。同时提取肿瘤组织DNA检测gsp基因序列。结果在20例肿瘤标本中10例gsp癌基因突变阳性(50%)。SST干预后体内外GH分泌大多受到不同程度抑制,个别表现出刺激效应,但与gsp癌基因表达无统计学相关性。结论短期使用SST对大多数GH腺瘤患者体内和体外均有抑制GH水平作用,少数患者具有天然耐药性。

氟化聚乙烯亚胺衍生物构成的胶束载体的构建、表征及其在跨血-脑屏障递送中的作用研究

目的:探讨由氟化聚乙烯亚胺(polyethyleneimine,PEI)衍生物构成的纳米胶束的构建、表征及其在跨血-脑屏障(blood-brain barrier,BBB)进行基因递送中的作用。方法:使用PEI和七氟丁酸酐(heptafluorobutyric anhydride,HFAA)通过化学反应合成PEI-HFAA,随后通过酰胺反应连接芥子酸(sinapic acid,SA)得到产物PEI-HFAA-SA(简称SPF),最终在SPF外包裹聚山梨酯80(polysorbate 80,PS80)得到最终产物PEI-HFAA-SA@PS80(简称SPFT)。通过傅里叶变换红外吸收光谱、核磁共振氟谱和核磁共振氢谱等对SPFT的分子键和元素组成进行分析,并通过动态光散射实验、琼脂糖凝胶阻滞实验和扫描电镜观察对其水合直径、质粒吸附及保护能力、载体质粒复合体的稳定性和形貌进行进一步表征。探究SPFT在小鼠神经胶质瘤细胞Neuro 2a中的基因转染效率和细胞毒性,通过尾静脉注射携带绿色荧光蛋白表达质粒的SPFT至C57BL/6J小鼠中,观察其在脑组织中的分布情况以及BBB内细胞的基因转染效果。结果:以SA和HFAA修饰以及PS80包裹的方法合成了SFPT。检测结果显示,SPFT水动力粒径100~200 nm,并且对质粒有一定的携带和保护作用。SPFT携带质粒在体外表现出良好的转染能力和生物相容性。体内实验显示,尾静脉注射后的SPFT在小鼠大脑中有聚集现象,能够携带质粒穿越BBB并进行基因递送。结论:SPFT具有一定生物相容性和良好的穿越BBB及基因递送能力,为脑部疾病的治疗药物递送提供了新的思路。

DNMT3a通过提升基因内部甲基化介导紫杉醇诱导的LINE-1异常表达

药物诱导的长散在重复序列LINE-1异常激活可促进细胞基因组不稳定,而基因组不稳定是促进肿瘤发生发展和耐药表型形成的重要因素。因此,探索LINE-1异常激活的分子机制具有重要的理论和临床意义。DNA甲基化是调控基因表达的重要方式,已知DNA甲基转移酶家族成员DNMT3a不仅能通过促进基因启动子甲基化抑制基因表达,还可通过增强基因内部甲基化上调基因表达。本实验室前期研究发现,将乳腺癌细胞暴露于化疗药物可诱导LINE-1异常高表达,但LINE-1启动子甲基化水平并无显著改变。本研究进一步探讨了在化疗药物压力下DNMT3a是否可通过增强LINE-1基因内部甲基化水平促进LINE-1在乳腺癌细胞中的异常高表达。ChIP实验和甲基分析结果显示,用化疗药物紫杉醇(PTX)处理乳腺癌细胞,不仅可以诱导DNMT3a表达,而且可以促进DNMT3a与LINE-1基因内部区域的结合,提升其基因内部甲基化水平,进而上调LINE-1的表达水平。利用表达载体增加细胞内DNMT3a的表达水平,可显著上调LINE-1基因内部的甲基化及基因的表达水平,而下调DNMT3a的表达可有效抑制LINE-1表达。上述研究结果表明,DNMT3a介导的基因非启动子区甲基化在药物诱导的LINE-1异常激活中发挥重要作用,为认识LINE-1在乳腺癌化疗耐药性形成过程中异常激活的机制提供了新思路。

CDP参与凋亡过程中远程调控元件mbr对于凋亡相关基因的转录调控作用

目的研究凋亡过程中SATB1降解后,CDP能否代替SATB1参与BCL2和NOXA的转录。方法在Jurkat细胞中过表达CDP,Real-time PCR检测BCL2和NOXA的转录。EMSA检测mbr元件和NOXA-SBS1上蛋白复合物的变化。结果在Jurkat细胞中,mbr元件和NOXA-SBS1上均存在SATB1蛋白,当SATB1和CDP比例改变后,mbr元件上SATB1蛋白复合物消失,取而代之的是CDP蛋白复合物。CDP可以促进NOXA的转录,抑制BCL2的转录。结论 SATB1与其同源异型蛋白CDP的比例变化可直接改变mbr增强子上蛋白复合物的组成。

应用聚合酶链反应技术构建人血小板反应素1基因第13外显子编码钙结合域突变体

目的:利用聚合酶链反应定点突变技术构建人血小板反应素1基因第13外显子编码钙结合域突变体。方法:实验于2005-03/06在南京医科大学第一附属医院心血管病研究所完成。选择南京医科大学第一附属医院体检中心健康体检者血标本提取人基因组DNA,设计、合成两对引物,将突变位点设计在引物内,突变位点包含限制性内切酶BseNI酶切位点,采用聚合酶链式反应定点突变技术,应用高保真TaqDNA聚合酶,通过三轮聚合酶链扩增反应对血小板反应素1基因的第13外显子进行扩增,将第13外显子碱基8831A置换为G,对最终扩增产物进行酶切鉴定和测序。结果:获得人血小板反应素1第13外显子编码钙结合域突变体,经酶切鉴定和测序分析,除引入突变点产生预期A8831→G突变外,其余碱基序列无改变。结论:采用聚合酶链反应体外定点突变技术,成功构建人血小板反应素1基因第13外显子编码钙结合域突变体,为研究血小板反应素1基因该位点突变导致血小板反应素1蛋白的结构、功能变化奠定了基础。

肿瘤坏死因子受体超家族成员TNFRSF19的研究进展

肿瘤坏死因子受体超家族(tumor necrosis factor receptor superfamily,TNFRSF)通过与肿瘤坏死因子超家族成员相互作用调节免疫应答,调控细胞生存、增殖和分化等。TNFRSF19是TNFRSF家族的新成员之一,主要表达于上皮细胞、毛囊和大脑组织细胞中。近年来相关研究表明,TNFRSF19在调节神经系统发育和维持干细胞干性中发挥重要生理功能。TNFRSF19在不同肿瘤中发挥截然相反的促癌或抑癌功能,其功能与肿瘤的组织来源密切相关。本文就TNFRSF19的生理功能及其在癌症中的最新研究进展进行简要综述。

SCD1保护胰岛β细胞避免IL-1β引起损伤的研究

目的探究硬脂酰辅酶A去饱和酶1(stearoyl-CoA desaturase 1,SCD1)改善IL-1β引起的胰岛β细胞功能损伤的效应。方法将SCD1基因插入pEGFP-C1载体中,构建pEGFP-SCD1过表达质粒,将该质粒转染进胰岛β细胞系INS-1和βTC-6细胞后,用IL-1β处理上述细胞,借助于蛋白免疫印迹、Tunel染色、葡萄糖/氯化钾刺激的胰岛素分泌实验(GSIS/KSIS)等方法研究SCD1对胰岛β细胞的保护作用。结果IL-1β处理后降低了胰岛β细胞SCD1的表达,过表达SCD1可逆转IL-1β处理引起的胰岛β细胞胰岛素合成和分泌下降以及凋亡增加的效应。结论SCD1能够保护胰岛β细胞免受IL-1β造成的功能损伤。

脂肪组织中自噬影响肥胖发病机制的研究进展

肥胖是由于脂肪细胞体积增大和数量增生而引起的脂肪组织异常或过度堆积导致的一种慢性代谢性疾病,由环境因素和遗传因素共同决定。近年来,自噬在调控脂肪细胞数量、脂肪生成和白色脂肪棕色化等过程中的作用引起了广泛关注。文章就脂肪组织中3种不同类型的自噬对脂肪生成、白色脂肪棕色化和脂肪代谢等过程的影响进行系统性总结回顾,旨在阐明自噬对脂肪组织功能及肥胖的影响,进而为肥胖的预防和治疗提供潜在靶点。

氯氮平对斑马鱼心脏发育的影响及机制研究

目的:探索氯氮平(clozapine,CLP)对斑马鱼心脏发育的损伤效应及相关机制。方法:以12.5μmol/L氯氮平(L⁃CLP)及25.0μmol/L氯氮平(H⁃CLP)处理斑马鱼胚胎72 h,显微镜下检测心脏形态、心率、静脉窦⁃动脉球(sinus venosus⁃bulbus arteriosus,SV⁃BA)距离等指标;实时荧光定量聚合酶链反应(RT⁃PCR)检测心脏发育相关基因NKX2.5、Hand2及Cmlc2表达;此外,H⁃CLP组处理24 h后,利用内质网抑制剂4⁃苯基丁酸(4⁃phenylbutyric acid,4⁃PBA)或多巴胺D2受体抑制剂溴隐亭(bro⁃mocriptine,BRC)联合处理48 h后,统计心脏功能指标,检测内质网应激分子(Chop、Bip)及凋亡相关分子(Caspase3、Bax/Bcl2)的表达。结果:CLP剂量依赖性导致斑马鱼心脏结构及功能损伤,Chop、Bip和Caspase3、Bax/Bcl2的表达增加;4⁃PBA及BRC显著缓解CLP诱导的心脏损伤及Chop、Bip、Caspase3、Bax/Bcl2的高表达。结论:CLP导致斑马鱼心脏发育受损,可能与抑制多巴胺D2受体、激发内质网应激有关。

增强子调控异常与恶性肿瘤的关系研究进展

增强子是真核生物基因组中一类特殊的转录调控元件,真核生物的基因组中分布着大量增强子元件。增强子可通过形成染色质环结构与靶基因的启动子相互作用,从而与启动子共同调控靶基因的转录。大量研究表明,遗传变异、表观修饰改变及转录因子异常均会直接或间接导致增强子功能失调或基因组增强子重塑,并与恶性肿瘤的发生和恶性进展密切相关。近年来高通量测序技术和数据库的快速发展有力推进了增强子研究的深度和广度。本文对增强子的结构特征、调控模式,及其在肿瘤发生和发展过程中调控异常的形成机制、增强子鉴定的主要技术手段和常用数据库等进行了简要的介绍和概括。

棕榈酰化转移酶9调控非小细胞肺癌增殖、迁移、侵袭及相关机制研究

目的:探讨棕榈酰化转移酶9(zinc finger DHHC-type containing 9,ZDHHC9)在非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC)中的表达及预后,及ZDHHC9对NSCLC细胞增殖、迁移和侵袭能力的影响及作用机制。方法:通过NCBI GEC数据库和基于基因表达水平值的交互式分析平台(gene expression profiling interactive analysis,GEPIA)数据库分析ZDHHC9在NSCLC中的表达及其与患者预后之间的关系。利用实时定量PCR(Real-time qPCR)检测正常支气管上皮细胞系(16HBE)及NSCLC细胞系(A549、H1299、H1703)的表达情况。在H1703和A549细胞系中敲降ZDHHC9,利用CCK-8实验检测细胞增殖能力,Transwell和划痕实验检测细胞迁移、侵袭能力,Western blot检测相关蛋白水平变化。结果:GEO和GEPIA数据库生物信息技术分析结果显示,ZDHHC9在NSCLC组织中较癌旁组织显著升高,并且ZDHHC9表达量与患者的无病生存率相关(P<0.01)。敲降ZDHHC9后,H1703和A549细胞增殖活力显著下降,同时侵袭和迁移能力受到抑制,并且敲降ZDHHC9降低NSCLC细胞脂肪酸合成关键酶的表达水平。结论:ZDHHC9可能通过调控NSCLC细胞脂肪酸合成促进NSCLC细胞的增殖、迁移和侵袭。

VPS13A在3T3-L1脂肪细胞分化过程中的表达及调控研究

目的:明确囊泡分选蛋白13A(vacuolar protein sorting 13 homolog A,VPS13A)在小鼠胚胎成纤维细胞(mouse embry-onic fibroblast cells,3T3-L1)分化过程中的表达水平;探索VPS13A对3T3-L1细胞的影响。方法:利用Western blot及Q-PCR法检测3T3-L1细胞在分化过程中VPS13A的表达,利用CRISPR/Cas9系统构建VPS13A稳定敲降细胞系,Western blot和油红染色检测VPS13A敲降后对3T3-L1细胞分化的影响。结果:VPS13A的表达在3T3-L1分化过程的早期降低,在分化的后期升高。敲降VPS13A后,3T3-L1细胞中脂滴增多,参与调控脂肪细胞分化基因的表达水平升高。结论:在3T3-L1细胞中VPS13A的表达水平在分化过程中被调控,敲降VPS13A可以促进3T3-L1细胞的分化成熟。

4′-甲醚-黄芩素对绒癌耐药细胞株多药耐药性的逆转作用研究

为探讨马鞭草中4′-甲醚-黄芩素对人绒癌JAR/VP16耐药细胞株的多药耐药逆转作用及可能的逆转机制,采用四甲基偶氮唑盐比色、透射电镜观察、逆转录多聚酶链反应、流式细胞术、基因芯片以及实时定量PCR等方法,检测到4'-甲醚-黄芩素对化疗药物具有协同增效作用,显著逆转耐药细胞对鬼臼乙叉甙(VP16)、甲氨蝶呤(MTX)及更生霉素(KSM)的耐药性,该药物作用后,耐药细胞超微结构呈现凋亡样改变,细胞凋亡率增高并出现明显凋亡峰.此外,耐药细胞中MDR1、MRP1、MRP2、MRP6、AHR、COMT、FGF2等耐药相关基因以及Bcl-2、BFL1、NAIP、p63等凋亡抑制基因表达降低,而Apaf-1、ASC、ATM、Bad、Bak、Bax、BimL等凋亡促进基因表达升高.上述实验结果表明:4′-甲醚-黄芩素对绒毛膜癌耐药细胞具有显著的耐药逆转作用,这种逆转作用可能是通过降低耐药基因表达、促进细胞凋亡实现的.

脱氧胆酸通过NF-κB调节人胆管癌细胞系QBC939增殖和凋亡的研究

目的:研究脱氧胆酸对人胆管癌细胞凋亡和增殖的影响;以及该影响的细胞内信号转导途径。方法:用四甲基偶氮唑蓝[3鄄(4,5鄄dimethylthiazole鄄2yl)鄄2,5鄄diphenylte鄄trazoliumbromid,MTT法]比色法和流式细胞仪技术(flowcytometry)检测脱氧胆酸对QBC939细胞增殖和凋亡的影响。用荧光素酶报道基因技术检测在脱氧胆酸作用前后核转录因子(nuclearfactorkappaB,NF鄄κB)活性的改变。再将NF鄄κB的天然抑制因子IκB转染人胆管癌细胞系QBC939,观察用IκB抑制NF鄄κB后肿瘤细胞的增殖和凋亡的情况。结果:脱氧胆酸能抑制胆管癌细胞的增殖、促进其凋亡,这一抑制作用的机制是通过抑制NF鄄κB实现的,用NF鄄κB的抑制因子IκB作用于QBC939细胞,所起的作用与脱氧胆酸相似。结论:脱氧胆酸能通过抑制NF鄄κB的活性,抑制QBC939细胞的增殖,并促进其凋亡。

重组腺相关病毒介导的TIMP-1载体的构建及鉴定

目的:构建及鉴定载入金属蛋白酶组织抑制因子1(TIMP鄄1)的重组腺相关病毒载体。方法:应用基因重组的方法构建含全长TIMP鄄1的重组腺相关病毒骨架质粒(pAAV鄄TIMP鄄1),利用磷酸钙沉淀法将腺相关病毒载体质粒共转染入HEK293细胞中,分别装配成rAAV鄄TIMP鄄1和rAAV鄄hrGFP,将rAAV鄄hrGFP转导HT1080细胞测定重组病毒的滴度,Westernblot方法检测rAAV鄄TIMP鄄1在HT1080细胞中的表达情况。结果:成功构建rAAV鄄TIMP鄄1,病毒滴度达到109TU/ml,转导细胞后,转导组TIMP鄄1的表达水平高于对照组。结论:构建的rAAV鄄TIMP鄄1,为基因修饰胰岛移植提供了新的手段。

Wortmannin对胰腺癌细胞增殖和生存的影响

目的:观察Wortmannin对胰腺癌PANC-1、CFPAC-1细胞株增殖、凋亡的影响,探讨Wortmannin抗肿瘤的作用机制。方法:采用噻唑盐比色法(MTT)、平板克隆试验、流式细胞分析测定Wortmannin对PANC-1、CFPAC-1细胞增殖、凋亡的影响。结果:用不同浓度Wortmannin培养CFPAC-1细胞24、48、72h后,其最大增殖抑制率分别为:10.6%、30.3%、18.9%(P<0.05),且呈明显的计量依赖效应,而Wortmannin对PANC-1细胞无明显抑制作用。Wortmannin可明显抑制CFPAC-1细胞克隆的形成(P<0.01),对PANC-1细胞克隆形成也有一定的抑制作用(P<0.05)。但Wortmannin对两株细胞均无诱导凋亡的作用。结论:Wortmannin通过阻断PI3K/Akt信号通路抑制胰腺癌细胞株增殖,达到抗肿瘤的作用;不同的细胞系对Wortmannin的敏感性不同。