N端携带HBGAs受体结合表位的兔出血症病毒嵌合VP60蛋白的表达及其免疫原性

将HBGAs受体结合表位插入兔出血症病毒(RHDV)衣壳蛋白VP60的N端,分析嵌合VP60蛋白的表达及病毒样颗粒(VLPs)形成情况,并研究N端HBGAs受体结合表位的插入对嵌合VP60蛋白免疫原性的影响。通过VP60蛋白N端起始位点HBGAs受体结合表位的插入,获得表位插入的VP60基因。利用Bac-to-Bac系统构建杆状病毒重组质粒,命名为Bacmid-VP60-CR,转染Sf9昆虫细胞后,得到重组杆状病毒rBac-VP60-CR,经HA、IFA和Western Blot鉴定,结果显示,重组蛋白VP60-CR在Sf 9昆虫细胞中得到高效表达,电镜观察显示其可形成与VP60类似的VLPs结构。将重组蛋白免疫2月龄RHDV血清阴性的新西兰兔,200μg/只,免疫后每周采血检测HBGAs表位抗体水平,同时在免疫后14 d,以RHDV WF株攻毒观察VP60-CR重组蛋白的免疫保护效果。结果显示,与VP60对照相比,VP60-CR蛋白可产生更高水平的针对HBGAs表位的抗体水平,且VP60-CR免疫兔可完全抵抗RHDV强毒的攻击。本研究构建了一种N端插入HBGAs受体结合表位的嵌合VP60蛋白,为研究高免疫原性兔出血症基因工程疫苗抗原奠定了基础。

N端B细胞表位缺失的兔出血症病毒VP60蛋白的表达及其免疫原性

本研究将A3C单抗识别的VP60蛋白NTA区域作为识别标记,设计一系列编码VP60 NTA区域重叠多肽的基因序列并连接于pGEX-4T-1载体,确定A3C单抗识别的精确表位。然后构建重组质粒Bacmid-VP60△A3C,将Bacmid-VP60△A3C转染Sf9昆虫细胞,得到重组杆状病毒rBac-VP60△A3C。RT-PCR、HA、IFA和Western Blot鉴定结果表明,重组蛋白VP60△A3C在Sf9细胞中高效表达,电镜观察显示其形态和结构与兔出血症病毒VP60蛋白类似。将重组蛋白VP60△A3C以每只200μg免疫2月龄RHDV血清阴性的新西兰兔,免疫后14 d,以兔出血症病毒WF株攻毒新西兰兔。结果表明,免疫组无死亡,而对照组全部死亡。本研究结果为制备表位缺失的兔出血症亚单位疫苗奠定了基础。

我国首株兔出血症病毒2型的致病性及病理学初步研究

为深入研究国内首次发现并鉴定的兔出血症病毒2型(RHDV2)四川分离株SC2020/04的致病性,用SC2020/04 RHDV2分离株,以皮下注射方式感染25日龄仔兔和4月龄成年兔,记录家兔发病情况,对病死兔进行剖检,并取肝脏样品进行血凝(HA)和核酸检测,取心、肝、脾、肺、肾、十二指肠等组织制作病理切片,进行病理学研究。试验结果显示,感染后仔兔18 h出现死亡,成年兔40 h出现死亡,死亡率均为5/5;感染后试验兔出现典型兔瘟临床症状,濒死时四肢抽搐、角弓反张,部分死亡兔可见口鼻流出红色血液;剖检主要病变为肝脏肿大并伴有明显的小叶样改变,脾肿大,肺、肝、脾和肾出现充血和弥漫性瘀点出血,腹腔内有血样渗出物;血凝试验结果显示,病死仔兔和成年兔肝脏血凝效价没有明显差异;采用鉴别经典RHDV/RHDV2的RT-PCR方法检测攻毒死亡兔肝脏样品,结果显示为RHDV2阳性;病理学观察可见多脏器严重出血、肿胀,淋巴细胞和中性粒细胞大量浸润,病死仔兔十二指肠组织严重糜烂,成年兔十二指肠病变较轻。本研究对我国首个RHDV2毒株进行了致病性初探和病理学观察,研究结果可以为RHDV2疫苗研发和致病机理研究奠定基础。

兔出血症病毒2型的分离鉴定与序列分析

兔出血症(Rabbit hemorrhagic disease,RHD)是由兔出血症病毒(Rabbit hemorrhagic disease virus,RHDV)引起的一种具有高度传染性、急性致死性兔病。兔出血症病毒2型(RHDV2)引起的RHD主要在欧洲流行,病兔的死亡率高达90%,而用经典RHDV毒株制备的疫苗几乎不能预防家兔感染RHDV2,从而给世界养兔业造成了巨大的经济损失。2020年4月,中国四川省某兔场首次发生由疑似RHDV2引起的RHD,笔者所在实验室通过红细胞凝集试验(Hemagglutination,HA)、逆转录-聚合酶链式反应(Reverse transcription-polymerase chain reaction,RT-PCR)扩增、vp60基因序列分析和病毒复制试验,对采集的病死家兔肝脏样本进行病原鉴定。HA结果显示,部分病死家兔的肝脏样本不能引起血凝现象;RT-PCR结果显示,样品中出现了RHDV2的特异性条带。对新发现毒株cDNA的RT-PCR产物进一步分析发现,所扩增vp60基因核苷酸序列与经典RHDV vp60基因核苷酸序列的一致性为77.5%~80.1%,与RHDV2 vp60基因核苷酸序列的一致性为93.6%~96.1%,并且与RHDV2处于同一个进化分支。病毒复制试验结果显示,用病死家兔肝脏组织与磷酸缓冲盐溶液(Phosphate buffer saline,PBS)按1 g∶10 ml混合后制成的悬液分别人工感染5只非免疫25日龄未断奶仔兔和5只2月龄兔,在24~48 h全部死亡。基于以上试验结果,确定本研究新发现的RHDV毒株为RHDV2,并将其命名为SC2020,这是在中国首次发现RHDV2毒株,应引起高度重视。

兔出血症病毒2型TaqMan探针荧光定量RT-PCR检测方法的建立及应用

以新发生的兔出血症病毒2型(RHDV2)SC 2020/04株VP60基因序列为参考,设计出1对特异性引物和TaqMan探针,建立了一种快速、灵敏且特异的用于检测新型病毒的荧光定量RT-PCR检测方法。试验结果显示:本研究建立的方法,标准曲线线性关系良好,R^(2)值达到0.999;其特异性较好,与兔出血症病毒1型(RHDV1)、仙台病毒(SV)和轮状病毒(RRV)病原均无交叉反应;灵敏性高,最低检出量为1μl 1×10拷贝;且重复性良好,批内和批间试验的变异系数平均值均小于2%。临床检测结果表明,利用该方法对108份临床病料进行检测,检出RHDV2阳性样品72份,检出率为66.7%,明显高于常规的RT-PCR方法(62.0%)。结果证明,新建立的TaqMan荧光定量RT-PCR方法适合于RHDV2感染的特异性诊断。

山羊疱疹病毒Ⅰ型的分离鉴定与致病性

为了查明引起2013—2014年江苏多地育肥羊出现呼吸道症状为主的疾病的病因,通过采集发病羊场鼻拭子,采用细胞接毒分离培养、病毒蚀斑纯化、病毒形态结构观察和病毒核酸鉴定,分离到一株山羊疱疹病毒Ⅰ型(caprine herpesvirus 1,CpHV-1),命名为JSHA1405;并对其进行了致病性试验。分离鉴定结果表明:病料接种MDBK细胞后,盲传至第3代时产生明显细胞病变;电镜下可见直径约100nm有囊膜的病毒粒子;gB全基因测序表明其为CpHV-1,序列比对显示JSHA1405株与CpHV-1瑞士分离毒E/CH株相似性最高,为99.2%。致病性试验表明,JSHA1405分离株可导致山羊发热持续一周以上,体温最高可达41.8℃。山羊感染后临床症状明显,表现为精神沉郁、流浆液性或脓性鼻涕,可通过鼻腔/粪便排毒。山羊感染后第7天出现中和抗体,第28天达到最高。这是国内首次报道CpHV-1的分离鉴定及致病性,分离毒JSHA1405具有较强的致病性,为CpHV-1病原学及防控技术研究提供依据与参考。

犬小孢子菌、石膏样小孢子菌、须毛癣菌多重PCR检测方法的建立及初步应用

宠物浅表皮肤真菌病主要由犬小孢子菌、石膏样小孢子菌、须毛癣菌感染引起。本研究根据3种真菌基因内转录间隔区(internal transcribed spacer,ITS)区域的序列差异设计4条引物,通过优化多重PCR反应条件,建立了一种可同时快速检测这3种真菌的多重PCR,同时对其特异性、灵敏性、重复性进行分析。结果显示,建立的多重PCR方法对犬小孢子菌、石膏样小孢子菌、须毛癣菌基因组DNA均可扩增出特异性预期片段,条带大小分别为286、596、188 bp;最低检测限(灵敏性)分别为12.6、8.8、13.6pg/μL;被检测的6份人工模拟样品扩增结果准确。应用该多重PCR方法检测27份人临床皮屑样品和43份宠物犬、猫毛发样品,结果显示阳性检出率分别为74.07%(20/27)和83.72%(36/43);采用常规真菌分离培养法从阳性样品中获得10株致病性真菌,分离率为17.86%(10/56);两种检测方法的种属鉴定结果表明多重PCR法优于常规方法。本研究建立的多重PCR检测方法简便、特异、灵敏,可同时对宠物浅表真菌病原作出快速诊断与鉴别。

新西兰兔RBM4基因的克隆、序列分析及组织表达

为分析RBM4基因在新西兰兔不同组织的表达差异情况,本研究根据GenBank中公布的穴兔RBM4基因序列设计了特异性引物,从兔肾脏中扩增出RBM4基因并进行了生物信息学分析,同时采用实时荧光定量PCR技术研究了RBM4基因在新西兰兔各组织中的表达差异。结果表明,扩增出的新西兰兔RBM4基因长度为1080 bp,编码359个氨基酸。序列比对结果显示,新西兰兔与穴兔、牛、鼠、人、鲑鱼等动物RBM4基因的核苷酸一致性为44.1%~99.8%。进化树分析结果表明,新西兰兔RBM4基因与其他哺乳动物RBM4基因亲缘关系较近。实时荧光定量PCR结果显示,RBM4基因在新西兰兔的心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏和脑中均有表达,其中在肾脏中表达量最高,在脑中表达量最低。本研究成功克隆了新西兰兔RBM4基因,并研究了其mRNA在兔各组织中的表达情况,为研究兔RBM4基因的表达及其生物学功能奠定了基础。

猪巴氏杆菌Lh-4株单因子发病模型的建立

人工接种猪巴氏杆菌Lh-4株于SPF仔猪,以复制猪肺疫发病模型,并探讨其发生发展的规律,为今后研究该病的防治提供依据。选取5头30日龄SPF仔猪,随机分为攻毒组3头和对照组2头。联合采用滴鼻和皮下注射攻毒(109 CFU/头),攻毒后每天观察临床症状和测定直肠温度,并分别于0、4、10、16 d采集鼻拭子和抗凝血,进行细菌PCR检测。死亡和16 d时剖检,进行组织学观察,同时进行巴氏杆菌在各组织中的分布测定及细菌再分离,最后对具有类似临床症状的病原进行检测。结果发现,攻毒组有2头出现包括发烧、败血症、支气管肺炎、胸膜炎、心包炎等典型的猪肺疫临床症状和病理变化,1头出现了轻微临床症状。所有攻毒猪均能再分离到巴氏杆菌,其中典型发病猪各组织脏器中均有巴氏杆菌的分布,但轻微发病猪仅在心、肺、扁桃体和淋巴结中检测出。发病猪其他有类似临床症状的相关病原检测均为阴性。成功建立了猪肺疫发病模型,为巴氏杆菌病的发生发展规律,致病机制及其他巴氏杆菌临床分离株致病性的确定提供依据。

1株猪鼻支原体的分离鉴定及致病性

猪鼻支原体是猪场感染率极高的一种支原体,可引起多发性浆膜炎、关节炎等症状。目前尚未建立标准的猪鼻支原体发病模型,也缺乏标准强毒株。本研究从某猪场发病猪的关节液中分离得到一株支原体,通过PCR检测、菌落形态观察、菌体形态电镜分析、菌株MLST分型等方法对其进行了鉴定,确认其为猪鼻支原体。为评价菌株致病性,将该分离株接种1月龄自然分娩不吃初乳猪(SF-pCD猪),试验猪在感染后出现关节肿胀、跛行等临床症状,日增重显著低于对照组,并出现部分死亡。剖检结果显示感染组出现胸膜炎、腹膜炎、心包炎及关节炎,肺部组织病理分析显示为间质增宽,无虾肉样病变。从发病猪的扁桃体、肺、心及关节积液中可再次分离到攻毒株。综上,本研究分离获得一株猪鼻支原体,人工感染猪后可出现典型的发病症状,猪鼻支原体发病模型的建立为致病机制及疫苗研究奠定了重要的基础。

4种重要外来病毒高通量液相芯片检测方法的建立

为建立小反刍兽疫病毒(PPRV)、西尼罗病毒(WNV)、裂谷热病毒(RVFV)和南非型口蹄疫病毒(SAT FMDV)的高通量液相芯片检测方法,根据GenBank上公布的PPRV的N蛋白基因序列、WNV的E蛋白基因序列、RVFV的S片段基因序列和FMDV的5′UTR区基因序列,并基于各基因保守区设计相应的引物和探针。通过对多重PCR的上游、下游引物比例、杂交温度、杂交时间进行条件优化,并验证检测方法的特异性和敏感性。敏感性试验显示,该方法对于PPRV、WNV、RVFV以及FMDV 4种病毒最低检出量分别为5.78×10^(3)、2.15×10^(3)、2.98×10^(5)、9.54×10^(4) copies/μL。本研究建立的高通量液相芯片检测方法能够同时快速地检测4种外来病病毒,具有良好的特异性、敏感性和稳定性,对于流行病学调查和防范外来动物疫病具有重要的意义。

检测兔出血症病毒HBGAs表位抗体间接ELISA方法的建立

为建立检测兔出血症病毒(RHDV)衣壳蛋白VP60上HBGAs表位抗体的间接ELISA方法,将谷胱甘肽磁珠纯化的含HBGAs表位的重组蛋白包被酶标板,经间接ELISA的最佳反应条件优化试验确定:抗原的包被质量浓度为6μg/mL,标准阴阳性血清稀释度为1∶200,封闭液选用5%脱脂乳,辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG最佳稀释度为1∶10000。经特异性试验、敏感性试验、血清抗体检测,结果显示,该方法具有较高的特异性、敏感性,也可以检测出疫苗免疫后不同时间兔血清的抗体水平变化。说明以HBGAs表位为包被抗原建立了间接ELISA方法,为RHD疫苗的免疫效力评估提供了可行的技术手段。

母源抗体及不同疫苗对小反刍兽疫疫苗免疫的影响

为了解影响小反刍兽疫(PPR)疫苗免疫效果的因素,并为制定科学合理的PPR免疫程序提供依据,本试验选取不同PPR母源抗体水平的羔羊进行分组并免疫PPR疫苗;于不同时间免疫PPR、羊痘、口蹄疫疫苗,定期采血,采用商品化ELISA试剂盒检测抗体变化水平。结果表明,母源抗体严重干扰PPR疫苗的免疫效果,免疫羊痘疫苗和口蹄疫疫苗不会对PPR疫苗的免疫效果产生干扰。因此,在生产实际中需要做好羔羊PPR母源抗体水平的监测,根据监测结果制定科学合理的免疫程序。

新西兰兔Nrf2基因的克隆、序列分析及组织表达

为分析Nrf2基因在新西兰兔不同组织的表达差异情况,本试验根据GenBank公布的穴兔Nrf2基因序列设计了特异性引物,从兔肝脏中扩增出Nrf2基因并进行了生物信息学分析,同时采用实时荧光定量PCR技术研究了Nrf2基因在新西兰兔各组织中的表达差异。结果显示,扩增出的新西兰兔Nrf2基因长度为1 758 bp,编码585个氨基酸。序列比对结果显示,新西兰兔与穴兔、人、牛、鼠、斑马鱼等各种属动物Nrf2基因的核苷酸一致性为50.70%~99.83%。进化树分析表明Nrf2在物种间具有较高的保守性。实时荧光定量PCR结果显示,Nrf2基因在新西兰兔的心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏和脑中均有表达,且肾脏中表达量最高,脾脏中表达量最低。本试验克隆了新西兰兔Nrf2基因,并研究了其mRNA在兔各组织中的表达情况,为开展兔Nrf2/ARE信号通路的研究奠定了基础。

鸡滑液囊支原体活疫苗(MS-H株)同时免疫对新支二联活疫苗免疫效力影响的调查

为了解新支二联活疫苗和鸡滑液囊支原体活疫苗之间有无相互影响,选用70只1日龄SPF鸡随机分为4组进行比对试验,其中:G1组20只,联合免疫新支二联苗活疫苗和鸡滑液囊支原体活疫苗(MS-H株);G2组20只,为新支二联活疫苗单独免疫组;G3组20只,为传染性支气管炎病毒(IBV)攻毒组;G4组10只,为空白对照组。免疫后21 d时采血,血凝抑制(HI)试验进行新城疫(ND)血清抗体检测,同时G1、G2和G3组IBV强毒点眼攻毒,并于攻毒后第5天剖检,进行气囊评分。所有试验鸡剖检时,采集气管进行IBV再分离及病理观察。结果:G1和G2组的NDV抗体阳性率分别为94.74%和100%,其平均效价分别为4.26和4.35,剩余2组阳性率均为0;气管IBV再分离结果显示G1和G2组新支二联苗的保护率分别为88.24%和89.47%;气管病理学观察显示G3组出现了典型的传染性支气管炎(IB)病理变化,而G1组和G2组未出现明显IB病理变化。研究表明,同时免疫MS-H活疫苗并未对新支二联活疫苗的免疫效力产生影响。

4种家兔呼吸道致病菌多重PCR的建立及初步应用

为建立检测家兔铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)、肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae)、多杀性巴氏杆菌(Pasteurella multocida)和支气管败血波氏杆菌(Brodetella bronchiseptica)的多重PCR检测方法,参考GenBank数据库中登录的铜绿假单胞菌gyrA基因、肺炎克雷伯氏菌rcsA基因、多杀性巴氏杆菌KMT1基因和支气管败血波氏杆菌flaA基因,设计4对特异性引物,建立能同时扩增4种家兔呼吸道致病菌核酸的多重PCR检测方法,并进一步对其特异性和敏感性进行检测。特异性检测结果显示,该方法能同时扩增出4种家兔呼吸道致病菌的核酸,而对兔出血症病毒、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、产气荚膜梭菌、奇异变形杆菌与肠炎沙门菌无特异性扩增条带,说明该方法特异性良好。敏感性检测结果显示,该方法对铜绿假单胞菌、肺炎克雷伯氏菌、多杀性巴氏杆菌和支气管败血波氏杆菌检测的灵敏度分别为2.5×10^(-1),2.5×10^(0),2.5×10^(-2),2.5×10^(-2)μg/L。用建立的多重PCR方法对临床样本进行检测,结果表明,该方法可以快速并且特异地鉴别4种细菌病原的单独或混合感染,与单一PCR检测方法相比无显著性差异(P>0.05)。该方法的建立为家兔呼吸道疾病临床鉴别诊断和4种细菌病原的分离鉴定提供重要的技术手段。

鉴别家兔多杀性巴氏杆菌与支气管败血波氏菌的双重TaqMan qPCR方法的建立

为提高家兔呼吸道疫病主要细菌性病原检测的可靠性和标准化,根据GenBank中多杀性巴氏杆菌(Pasteurella multocida) Kmt基因与支气管败血波氏菌(Bordetella bronchiseptica) Fla基因分别设计特异性引物和探针,对反应条件进行优化,建立兔多杀性巴氏杆菌和支气管败血波氏菌双重TaqMan qPCR方法,并初步用于检测家兔肺脏及鼻拭子临床样本。结果显示,该方法建立的标准曲线在标准品浓度为2.35×106~2.35 copies/μL时有良好的线性关系;与绿脓杆菌、肺炎克雷伯菌、大肠杆菌、沙门菌、产气荚膜梭菌无交叉反应;最低检测限均为2.35 copies/μL;批内、批间重复性检验变异系数均小于2%。检测70份临床样本DNA结果显示,多杀性巴氏杆菌阳性率为50.0%,支气管败血波氏菌阳性率为42.9%,混合感染率为21.4%,该方法与细菌分离培养和常规PCR符合率分别为80.0%、 92.0%。以上数据表明,本研究建立的双重TaqMan qPCR方法特异性强、灵敏度高、重复性好,无需病原菌的培养即可用于临床样品的快速检测,为兔多杀性巴氏杆菌、支气管败血波氏菌的实验室诊断及流行病学调查提供了快速、高效、准确的检测方法。