动物疫病防控与兽医信息技术应用研究进展

回顾信息技术在国内外动物疫病防控的应用概况,针对中国兽医信息技术应用的现状及与国外的差距,提出"十三五"期间如何建设具有一定水平,又有中国特色的重大动物疫情应急指挥平台。建议将风险分析与预警预报技术相结合,提高GIS系统与风险分析在预警体系中的应用。进一步开展动物疫病综合防控信息化工作,替代传统防疫指挥调度管理方式,给重大动物疫病指挥部门带来一种全新高效的防控指挥模式。利用动物疫病大数据与数据挖掘技术及其模型方法论实现预警决策模型,构建智能化畜产品质量安全管理创新体系。使用大数据处理技术,分析新的数据类型和未充分利用的数据源,为未来智能化远程动物疾病诊断提供技术支撑,有效提高动物疫病防控的信息化管理程度。

江苏省部分地区动物弓形虫病血清学调查

以间接血凝(IHA)试验方法对江苏省部分地区(徐州、连云港、盐城、宿迁、南通、泰州、扬州、南京、常州、宜兴、昆山)动物弓形虫病进行血清学调查。试验血清样品稀释度在1∶64时,致敏血球达到50%以上凝集的血清样品判为阳性。结果在所调查的1 100份血清样品(猪、牛、羊、猫、狗等动物)中弓形虫抗体呈阳性者为145份,占总调查血清数的13.2%,其中939份猪血清样品中阳性样品数120份,占总调查猪血清样品的12.8%,总体反映出江苏省内动物弓形虫病感染的概况。

鸡毒支原体和大肠杆菌混合感染病例的实验室诊断

报道了一例鸡毒支原体和大肠杆菌混合感染病例的实验室诊断。应用细菌学方法无菌取肝脏和关节肿疱液接种鲜血琼脂培养基进行细菌分离,挑取鲜血琼脂培养基上均一生长的菌落划线接种于麦康凯斜面用于细菌鉴定,将分离的大肠杆菌涂布鲜血琼脂培养基进行药敏试验。取关节肿疱液接种KM2液体培养基,取关节肿疱液及其不同代次的KM2培养物进行支原体PCR检测。结果从发病鸡肝脏中分离到大肠杆菌,该菌株对丙氟哌酸、氟苯尼考等药物敏感;从关节肿疱液及其1～3代KM2培养物中均扩增出鸡毒支原体的基因片段;说明该群病鸡发生了鸡毒支原体和大肠杆菌的混合感染。

出血性大肠杆菌O157：H7 Stx2B-Tir-Stx1B多价融合蛋白表达及免疫原性研究

为了更好防治由出血性大肠杆菌O157∶H7引起的疾病,尝试研制基因工程疫苗,其中亚单位疫苗时具有很大优势。构建表达tir和stx1b的融合基因,将tir基因中间295个氨基酸残基(Tir295)与stx1b亚基基因72个氨基酸串联构建pGEX-stx2b-tir-stx1b重组质粒,将其转化于BL21(DE3),用IPTG进行诱导表达,经SDS-PAGE电泳检测,该融合蛋白获得了高效表达,目的蛋白表达量占菌体总蛋白含量的30%左右。重组蛋白纯化后皮下途径免疫小鼠,能够诱导高滴度(105)的IgG,鼻腔内途径免疫小鼠不仅能够诱导高滴度(104)的IgG,还能诱导高达102的IgA。二免后攻击50LD50的EHECO157∶H7,相对于对照组,免疫组粪便中排菌量明显降低、排菌时间明显缩短。结果表明:该融合蛋白免疫原性良好,并且由Tir、Stx2b和Stx1b三部分抗原组成,可刺激机体产生针对转位紧密素受体(Tir)和志贺毒素(Stx)的抗体,在EHECO157亚单位疫苗设计或单克隆抗体抗制备中具有重要价值。

动物源性人兽共患细菌病防控生物新制剂的研究Ⅰ．分泌抗大肠杆菌O157：H7单克隆抗体杂交瘤细胞株的建立

将E．coli O157：H7（EHEC—O157：H7）用甲醛灭活、超声破碎，免疫BALB／c小鼠，制备免疫脾细胞；与SP2／0骨髓瘤细胞融合后，获得7株分泌抗E．coli O157：H7单克隆抗体（mAbs）的杂交瘤细胞株，分别命名为F5、B8、E7、G9、G11、F1和C3，Ig亚类分别是IgG2ak、IgG2aK、IgG1K、IgMK、IgMh、IgMK和IgG2aK。用间接ELISA检测，E7和F1细胞培养上清液的效价为1．6×10^3，腹水效价均为1×10^11；C3、F5、B8、G9和G11细胞培养上清液的效价为1×10～2×10^2，腹水效价均为1×10^3。相加ELISA结果显示，F1、G9和G113株mAbs对应相同的抗原表位，而其它4株对应不同的抗原表位。用间接ELISA分析特异性，7株mAbs与某些其他血清型的大肠杆菌有交叉反应。Westernblotting表明，c3、E7和F13株mAbs在蛋白分子量28×10^3处有特异性条带，而其它4株mAbs则未显示蛋白带。

几种佐剂对肌肉注射猪支原体肺炎活疫苗免疫刺激能力的增强作用研究

为增强现有猪支原体肺炎活疫苗的免疫刺激能力以实现肌肉注射免疫,向现有活疫苗中添加几种不同佐剂,考察其经肌肉免疫后机体的免疫应答情况。结果表明,免疫刺激复合物基质佐剂和左旋咪唑+壳聚糖混合佐剂能有效激发细胞免疫应答和体液免疫应答;左旋咪唑+黄芪多糖混合佐剂能增强疫苗的细胞免疫刺激能力,而对体液免疫无作用;皂角素佐剂未显示明显的免疫增强效果。本试验结果为肌肉注射猪支原体肺炎活疫苗的开发奠定了数据基础。

动物疫病损失模型及治疗的经济评估模型构建

借鉴国外在动物卫生经济学方面应用的成功经验,探讨养猪场疫病发生造成巨大经济损失问题。通过疫病对种猪生产性能和育肥猪生产能力的损害,从兽医角度与经济角度两个方面去考虑:剖析诸因素相互间的关系及对猪只的经济影响,构建适宜地数学模型,为不同疫病对猪只造成的不同经济损失进行计算。以决策树法建立治疗控制措施的经济评估模型,对患某一种疫病的猪只做出治疗与否的最优辅助决策。并以江苏某大型规模化猪场为案例,运用成本收益分析对猪场2010-2012年疫病防控投入与产出进行估算和衡量。提出防控资源配置优化的建议。

弓形虫NT株猪体人工发病实验研究

目的探讨猪弓形虫病人工发病条件。方法将8头30日龄断奶仔猪分为A1组:腹腔注射1000万个弓形虫速殖子;A2组:腹腔注射5000万个弓形虫速殖子;A3组:腹腔注射1亿个弓形虫速殖子;A4组:空白对照。将8头5月龄育肥猪分为B1组:腹腔注射1000万个弓形虫速殖子;B2组:腹腔注射5000万个弓形虫速殖子;B3组:腹腔注射1亿个弓形虫速殖子;B4组:空白对照。以猪源刚地弓形虫强毒虫株南京汤山株(NT株)F275代攻毒观察临床症状及剖检变化。结果 A组实验猪3～7d后三种感染方式均出现典型的弓形虫病症状:持续高温、精神倦怠、呼吸困难、食欲不振等临床症状,A2、A3组感染猪弓形虫病症状明显且出现实验猪死亡,肺脏、肝脏、脾脏、淋巴结肿大、出血,并从血液和淋巴结中分离到了弓形虫。B组实验猪则没出现典型的临床症状。结论 30日龄断奶仔猪腹腔注射5000万个～1亿个弓形虫速殖子可出现典型的猪弓形虫病症状。

动物及动物产品标识与可追溯体系研究的探讨——与《动物及动物产品标识与可追溯体系模式研究》和《对动物及动物产品标识与可追溯体系思考与建议》两篇文章作者的商榷

现代化的动物产业发展模式,给动物产品安全带来诸多风险,导致食源性疾病患病人数增多,引发一系列动物产品安全事件。在养殖阶段,为控制疫病发生,提高生产效率,需要使用疫苗、药物及添加剂等,但是,超标准使用或违规使用,将导致动物产品药物残留、重金属等有害物质超标;在动物产品的加工、物流和销售等环节,均存在不合格卫生条件与违规使用添加剂等风险。在世界范围内,动物产品安全性成为重大公共安全问题,关系到产业可持续发展和人类身心健康,是亟待解决的社会问题。本文根据我国畜牧业生产现状、经济社会发展水平和动物源食品的消费特点,借鉴国外动物标识技术的经验,阐述作者2002年以来从事《动物及动物产品标识与可追溯体系研究》工作,提出建立我国动物及动物产品标识技术与可追溯管理的框架,如何与生产单位相结合推广溯源系统,跨省大流通格局与多部门管理的问题和可追溯体系的未来。

重大动物疫病防治数字化监控与风险评估及预警的构建

本文在阐述国外重大动物疫病防治数字化监控与预警体系规划研究的概况,国内应用研究现状及对策的同时,指出动物疫病预警研究是公共卫生应急及城市预警应急系统的重要组成部分。风险预警是风险分析的重要内容,风险分析是WTO等协定的构成部分,是技术性贸易措施的重要内容之一,是WTO各成员方检验检疫决策的主要技术支持。风险分析可保持检验检疫的正当技术壁垒作用,充分发挥检验检疫的保护功能,能强化检验检疫贸易的促进作用。针对重大动物疫病严重影响中国畜禽生产产业发展,由于疫病控制不及时,造成重大经济损失。同时,也影响中国畜禽(生猪、牛、禽)活体和胴体出口。为此,研究重大动物疫病风险评估及预警体系的框架构建,形成风险评估及预警决策模型;以及采用基于GIS的数字化监控系统,将流行病学数据库、地理图形、非空间应用模型和空间应用模型有机地结合,实现图形和数据资源共享。系统可及时跟踪疾病的蔓延,通过动物疫病流行病学图分析,可提出适宜的防治措施,达到重大动物疫病的预警预报目的。借鉴国外成功经验,提出适合国情的风险预警的研究内容,指出GIS系统与风险分析在预警体系中应用的注意点,为开展风险评估工作提供更多的素材,奠定风险管理基础。

嵌合双串联OVA T细胞表位的RHDV VP60蛋白免疫特性研究

为研究RHDV VP60作为载体容纳外源片段以及递呈外源T细胞表位的能力,将双串联卵清蛋白T细胞表位插入N端、C端以及替代N端氨基酸的方式获得3种嵌合蛋白,进行免疫试验。3种嵌合蛋白分别命名为DN1、DN2和DC,将蛋白进行浓缩、纯化及定量,利用透射电镜观察VLPs的形成,发现均可形成形态大小与VP60相似的VLPs。将3种嵌合蛋白分别腹腔注射C57BL/6雌性小鼠,利用间接ELISA检测首免后0、4和6周小鼠血清样品中VP60特异性抗体,结果表明嵌合蛋白组与VP60组均能够诱导产生较高水平的抗VP60特异性抗体,2组间无显著差异。首免后6周,利用合成的OVA多肽刺激脾淋巴细胞,ELISPOT检测特异性IFN-γ的分泌水平,结果表明3种嵌合蛋白均能诱导特异性IFN-γ的分泌。该研究扩展了VP60作为载体可携带的外源片段的耐受性及有效递呈T细胞表位的能力,为VP60-VLPs展示系统的研究提供了理论依据。

自制ISCOMATRIX与CpG联合的HCA587蛋白疫苗的制备及其免疫效应评估

目的确定自制免疫刺激复合物(ISCOMATRIX)作为HCA587蛋白疫苗佐剂的有效剂量,并探讨其与CpG联合作为HCA587蛋白疫苗佐剂的免疫效力和肿瘤治疗效果。方法应用透析法将Quil A、胆固醇和磷脂制备成ISCOMATRIX,经磷钨酸负染并采用透射电子显微镜观察自制ISCOMATRIX的结构。建立小鼠免疫模型,将联合CpG的HCA587蛋白疫苗与不同剂量的自制ISCOMATRIX佐剂混合,经尾根部皮下免疫小鼠;采用酶联免疫斑点试验(ELISpot)检测产生IFN-γ的脾细胞频数,采用酶联免疫吸附法(ELISA)检测血清HCA587特异性抗体水平。在小鼠右侧胁腹部皮下接种B16-HCA587肿瘤细胞建立荷瘤小鼠模型,按照处理方式不同将小鼠分为HCA587蛋白疫苗治疗组(接种100μL包含CpG与最佳剂量的自制ISCOMATRIX的HCA587蛋白疫苗)与PBS对照组(注射100μL的无菌PBS),使用游标卡尺测量肿瘤大小。结果自制ISCOMATRIX佐剂呈典型的蜂窝状结构,直径20~30 nm,大小均一。12、36μg(QuilA浓度分别为0.012%、0.036%)的自制ISCOMATRIX组小鼠脾细胞分泌IFN-γ的频数与商品化ISCOMATRIX阳性对照组比较,差异无统计学意义(均P>0.05),且显著高于CpG+36μg ISCOM对照组与PBS组(均P<0.0001);5μg与18μg自制ISCOMATRIX组小鼠分泌IFN-γ的脾细胞频数,高于CpG+36μg ISCOM对照组与PBS组(均P<0.0001),但低于商品化ISCOM组(P=0.004)。12、18与36μg自制ISCOMATRIX组的血清HCA587抗体水平与商品化ISCOM阳性对照组比较,差异无统计学意义(均P>0.05);与PBS组相比,12μg自制ISCOMATRIX组1×10^(4)倍稀释血清的抗体滴度显著升高(P=0.0062)。与PBS对照组相比,HCA587蛋白疫苗治疗组肿瘤生长速度减缓,且第35天测量时肿瘤大小显著较小(P=0.0181)。结论以12μg自制ISCOMATRIX作为佐剂联合CpG制备的HCA587蛋白疫苗能诱导有效的免疫应答,并抑制荷瘤小鼠的肿瘤的生长,具有一定的肿瘤治疗作用。

大肠杆菌O157:H7抗体胶体金免疫层析检测试纸条的研制

为建立快速检测鼠感染大肠杆菌O157∶H7后的抗体,本研究采用颗粒为20nm的胶体金溶液标记纯化的羊抗鼠IgG,制备金标探针,喷涂于玻璃纤维膜上;将大肠杆菌O157∶H7抗原和抗大肠杆菌O157∶H7单克隆抗体F1分别包被于硝酸纤维素膜上作为检测线和质控线,组装成鼠血清O157∶H7抗体胶体金免疫层析检测试纸条。实验结果表明,该试纸条仅与O157∶H7阳性鼠血清发生特异性反应,用该试纸条与常规间接ELISA平行比较检测O157∶H7免疫鼠血清,抗体效价分别为1×106和1×105,两者的敏感度相当。该试纸条操作简便,10min可出结果,适用于调查与追溯鼠O157∶H7感染状况时的现场检测。

免疫刺激复合物基质为佐剂的猪支原体肺炎活疫苗肌肉注射免疫效果评价

试验旨在探讨免疫刺激复合物基质(ISCOM-基质)作为猪支原体肺炎168株活疫苗佐剂使用的可行性,并考察其配合疫苗肌肉注射时的免疫效力和攻毒保护效力。首先以Quil A、胆固醇和磷脂为原料,采用透析法制备ISCOM-基质,然后将制备好的ISCOM-基质与活疫苗混合孵育,检验其对活疫苗的毒性。于体外用ISCOM-matrix直接刺激或与刀豆蛋白共同刺激淋巴细胞,观察细胞的增殖应答情况。而后将添加ISCOM-matrix佐剂的猪支原体肺炎活疫苗肌肉注射免疫动物,检测血清抗体水平及淋巴细胞增殖应答水平,于免疫后8周攻毒,评价攻毒保护效力。结果表明,所制备的ISCOM-基质不影响活疫苗的活力,并且在体外可直接或协同刀豆蛋白刺激淋巴细胞产生明显的增殖反应,最低起效浓度为0.01 ng/ml;当作为佐剂与活疫苗配合肌肉注射免疫时,可以显著诱导动物对疫苗抗原的细胞免疫应答,体液免疫应答亦有一定程度增强。用肺炎支原体强毒攻毒后25 d剖检,免疫组病变明显较攻毒对照组减轻,显示出较好的攻毒保护效果。

动物卫生风险管理机制构建及管理资源合理配置初探

为保障畜产品的有效供给和公共卫生安全,稳步提升中国动物卫生安全水平。本研究通过1个进口动物产品的风险分析为实例,阐述如何对影响中国动物卫生和动物源性食品安全开展风险评估,以达到提高动物卫生和食品安全的预警能力与防控水平,促进动物及其产品的国际贸易,为提高重大动物疫病防控和动物源性食品安全管理决策水平提供科学依据。

重组表达口蹄疫病毒T细胞表位猪细小病毒病毒样颗粒的制备

为增强表位疫苗的免疫原性,本研究将O型口蹄疫病毒(FMDV)VP1中编码T细胞表位肽(aa 21～aa 40)序列连接于猪细小病毒(PPV)VP2的5'端,并插入到杆状病毒供体质粒pFastBac HTA中,构建成重组转座载体pFastBac-FMDV-VP1-PPV-VP2,转化含有穿梭载体Bacmid的E.coli DH10Bac中,经蓝白菌落筛选获得重组杆状病毒表达质粒rBac-FMDV-VP1-PPV-VP2,转染昆虫草地夜蛾(Sf9)细胞,并在Sf9中进行了表达。电镜观察显示,表达的重组蛋白能够自我组装成病毒样颗粒rPPV∶VLP(FMDV)。用间接免疫荧光试验(IFA)、western blot分析表明,表达产物具有与PPV VP2天然蛋白相似的免疫原性。小鼠免疫实验证实,在低浓度FMDV抗原下能够产生特异性T淋巴细胞增殖反应;而且该病毒样颗粒能诱导机体产生抗FMDV特异性细胞免疫反应。

嵌合O型口蹄疫病毒多表位基因猪细小病毒VLPs载体疫苗的构建

综合运用生物信息学和分子生物学技术,模拟PPV VP2蛋白表面不同Loop区插入O型FMDV VP1蛋白上多表位基因(VP1:21～40、141～160和200～213残基)空间构象,并在VP2 N端引入通用型辅助性T淋巴细胞表位(PADRE),人工合成嵌合基因并克隆到杆状病毒转移载体pFastBac HTA中,转化E.coli DH10Bac感受态细胞,经三抗筛选,获得重组杆状病毒表达质粒rBac-FMDV VP1∶PPV VP2,用脂质体法转染Sf9细胞。对rBac-FMDVVP1∶PPV VP2感染的Sf9细胞,用间接免疫荧光试验(IFA)检测,具有特异性荧光;用Western-blotting分析,在64 000处出现一条特异蛋白条带;电镜观察,重组VP2蛋白能够自主组装成病毒样颗粒。红细胞凝集试验证实,表达的嵌合蛋白PPV∶VP2-FMDV∶VP1具有与全病毒类似的血凝活性。

大肠杆菌O157∶H7单克隆抗体胶体金免疫层析检测试纸条的研制

用E.coliO157∶H7菌体免疫BALB/c鼠,制备免疫脾细胞,与SP2/0骨髓瘤细胞融合,获得了16株分泌单克隆抗体（mAb）的杂交瘤细胞株。其中,1D3、2E7和2H7三株为O157∶H7特异单克隆抗体,Ig亚类分别为IgMκ、IgG2bκ和IgG2bκ,腹水抗体ELISA效价分别为103、105和106。用纯化的单克隆抗体2E7标记胶体金,制备金标抗体玻璃纤维素膜;将纯化的2H7和羊抗鼠IgG分别作为检测和对照捕捉抗体包被于硝酸纤维素膜（NC）上;组装成双抗夹心法O157∶H7胶体金免疫层析检测试纸条。用该试纸条可特异检测O157∶H7,敏感度为106CFU/mL,与相同单克隆抗体2H7和2E7建立的O157∶H7夹心ELISA检测方法的敏感度相当,试纸条简便快速,在1~5 min内可得出检测结果,便于O157∶H7的临床快速诊断与现场检测样品的快速筛查。

规模化猪场疫病传入风险分析模型的构建

疫病对猪场造成重大损失,是猪场发展的主要制约因素。为规范猪场管理,减少疫病,根据现今猪场疫病概况,以调查问卷及专家调查的方法确定疫病传入猪场的风险因素,再运用动物卫生风险分析技术模拟规模化猪场疫病传入的暴露模型,并构建风险评估数学模型,最后采取实例验证该模型。结果表明,该模型在定量评估猪场疫病发生风险可能性大小上是可行的。

肠出血性大肠杆菌O157∶H7鞭毛可变区基因片段的克隆、表达与免疫原性

肠出血性大肠杆菌(Enterohemorrhagic Escherichia coli,EHEC)O157∶H7是食源感染的人兽共患病原菌。鞭毛蛋白(H7)是EHEC O157∶H7重要的毒力因子,其编码基因为flic。该研究在体外克隆和表达flic基因的可变区,并检测其免疫原性,旨在为EHEC O157∶H7疫苗的研制提供候选抗原。PCR扩增到flic基因538～1 483bp的可变区,成功克隆入冷诱导表达载体pColdⅠ中,构建重组表达质粒。重组菌BL21(pCold I-flic)0.5 mmol/LIPTG过夜诱导,SDS-PAGE和Western blotting进行鉴定。Balb/c小鼠免疫和攻毒试验评价重组H7蛋白的免疫原性。结果显示:H7基因(flic)片段945 bp在pColdⅠ中成功表达,大小为31 000,能够与天然EHEC O157∶H7全抗血清反应;免疫小鼠存活率可以达到80%,而非免疫小鼠存活率仅为20%;免疫组粪便排菌数量显著低于对照组(P<0.05)。以上结果说明,H7鞭毛的可变区与菌体黏附密切相关,并且其诱导产生的抗体具有一定的抑制黏附作用,可以作为亚单位疫苗研制的候选抗原,在EHEC O157∶H7早期黏附时,协同Ⅲ型分泌系统蛋白降低菌体在肠道内的黏附。