基于matK基因和ITS序列的江苏地方豆类植物的亲缘关系研究

[目的]为探究江苏地方豆类植物之间的亲缘关系,从分子水平上对14种豆科植物进行了深入分析,旨在为后续豆类植物的种质创新和遗传改良提供理论依据。[方法]对14种豆类植物的mat K基因和ITS序列的扩增片段进行PCR产物直接测序,并结合Gen Bank数据库中的大豆(Glycine max)、菜豆(Phaseolus vulgaris)、红小豆(Vigna angularis)和绿豆(Vigna radiata)4种豆类植物基因组序列,利用Clustal W、MEGA 6.0、Bio Edit软件对这18种材料的mat K基因和ITS序列分别进行比对和分析,并以百脉根(Lotus corniculatus)为外类群,分别构建系统进化树并计算分化时间。[结果]18种豆类植物的mat K基因序列长度为750 bp,其中变异位点数为85,信息位点数为82,遗传距离的范围为0~0.099。ITS序列长度为795 bp,其中变异位点数为260,信息位点数为242,遗传距离的范围为0~0.292。以百脉根为外类群,用mat K基因序列和ITS序列分别构建的进化树显示,18种豆类植物可分为3组,即红小豆和绿豆分为一组,菜豆和大豆分别聚为一组。分化时间结果表明,大豆与菜豆的分化时间为19.02百万年前,菜豆与红小豆的分化时间为13.50百万年前,绿豆与红小豆的分化时间为2.94百万年前。[结论]序列分析和系统进化树的结果与形态学的特征基本一致,表明mat K基因和ITS序列可用于豆类植物属间亲缘关系分析。

江苏高粱发展前景分析

高粱是中国第五大粮食作物,是典型的耐旱、耐盐碱作物,是中国主要适合的酿造作物。江苏酒厂众多,对高粱需求量大。同时又有大量的海边滩涂和内地丘陵等边际土地发展高粱种植。为了江苏高粱产业的快速、健康发展,本文分析了江苏省发展高粱产业的前景及存在的问题,探讨了拓宽高粱利用的可能方向。

江苏淮北部分小麦品种品质性状相关重要基因的检测

为了解江苏淮北小麦品种重要品质性状相关基因状况,以20份近期审定的徐麦系列和淮麦系列小麦品种以及12份小麦对照材料为试验材料,采用SDS-PAGE电泳与PCR检测相结合,检测了小麦高分子量麦谷蛋白亚基;同时采用共显性PCR标记筛查1BL/1RS易位系以及Wx基因突变型。结果显示,江苏淮北小麦品种Glu-A1位点含3种亚基,其中1亚基占75%;Glu-B1位点有4种亚基,7+8亚基占60%;Glu-D1位点有3种亚基,5+10亚基占50%;1BL/1RS易位系有14份,占全部品种的70%;所有品种均为Wx基因野生型。

大豆HGm1 helitron转座元件的鉴定与生物信息学分析

[目的]helitron转座元件是近年来发现的一种结构新颖和转座方式独特的DNA转座子。我们从全基因组水平上对大豆基因组中拷贝数最多的helitron HGm1家族进行深入分析,旨在为后续进一步明确helitron转座元件在大豆及其近缘种基因和基因组演化中所起的作用提供帮助。[方法]利用基因组学和生物信息学的研究手段,我们对大豆HGm1家族的数量、结构特征、染色体分布、插入基因情况,基因片段的捕获及表达模式等进行了详细的研究。[结果]从公开发表的大豆基因组序列中共鉴定出254个HGm1转座元件。这些元件的3'末端十分保守,主要由GC含量较高的碱基组成。HGm1元件主要分布在AT丰富的区域,并在重组受到显著抑制的异染色质区域富集。研究还发现,68个元件被83个外源的转座元件插入;64个元件插入到编码蛋白的基因附近(<2 kb);115个元件携带154个完整的外源基因;52个元件有潜在的转录活性,在根、茎、叶、花和种子中,以及干旱胁迫和组织培养条件都有所表达。[结论]与玉米中有关helitron的研究结果相似,HGm1家族在大豆基因组中经常以巢式的结构存在,具有频繁插入到基因附近和捕获基因的现象,并且部分成员具有潜在的转录活性。而与玉米helitron不同的是,大豆HGm1 helitron家族主要分布在基因贫乏的异染色质区域。因此,HGm1家族在改变大豆基因结构和调节基因表达以及影响大豆基因组的演化过程中具有较为重要的作用。

棉花PGHNBS启动子维管束特异表达元件的分离及功能研究

PGHNBS是来源于陆地棉的一个CC-NBS-LRR类基因GHNBS的启动子,该启动子具有维管束特异表达特征。为了分离PGHNBS启动子的调控元件,对该启动子进行了缺失分析。将PGHNBS启动子6个部分缺失片段分别与GUS基因融合构建植物表达载体,这6个表达载体分别为PGN15(-1 420 bp～-28 bp)、PGN27(-1 300 bp～-28 bp)、PGN31(-1 071 bp～-28 bp)、PGN44(-959 bp～-28 bp)、PGN53(-807 bp～-28 bp)和PGN996(-604 bp～-28 bp)。用植物表达载体转化拟南芥,通过对转基因植物的GUS组织化学染色,进一步确认了韧皮部特异表达元件位于-1 071 bp～-959 bp区域。用PLACE进行相似性比较,发现该区域含有脱落酸(ABA)诱导元件、铜离子响应元件以及多个与抗逆相关的MYB转录因子的识别位点。另外,在-1 559 bp～-1 420 bp区域中存在增强子元件。

高等植物helitron转座子的研究进展

作为重复序列的一种主要类型,转座子在高等植物基因组中具有相当丰富的DNA含量,在改变基因结构、调节基因表达、影响基因组进化,以及创造新基因的过程中扮演着重要的角色。Helitron转座子是DNA转座子的一种,在转座过程中经常捕获基因或基因片段,以及插入到基因附近或基因内部,因此在改变基因组构成、影响基因组的进化过程以及改变基因型和表型等方面起着重要作用。该文对国内外近年来有关植物基因组中helitron转座子的结构特征、鉴定和分类方法、基因组中的含量和在染色体上的分布,以及转座扩增和基因片段的捕获等方面的研究进展进行了综述,并对helitron转座子研究过程中存在的问题进行了讨论,对今后helitron相关的研究进行了展望。

盐胁迫下苗期栽培大豆生理响应及Na^+动态平衡关键基因的表达

【目的】研究耐盐栽培大豆和盐敏感栽培大豆对盐胁迫的响应,特别是盐胁迫对大豆幼苗光合特性、离子含量及Na^+动态平衡相关基因表达的影响,通过比较盐胁迫下不同大豆品种的响应差异,揭示不同基因型大豆耐盐机制,为大豆栽培管理、耐盐品种的选育及人工调控提供理论参考。【方法】以耐盐栽培大豆(Y8D6008、Y8D6013)和盐敏感栽培大豆(Y8D6132、Y8D6136)为材料,选取长势一致的大豆幼苗于1/2×Hoagland营养液中培养,待第一片复叶完全展开时,营养液中加入Na Cl,每天递增50 mmol·L^(-1)到达处理浓度150 mmol·L^(-1),处理持续7 d。以不加Na Cl的1/2×Hoagland营养液作为对照,研究盐胁迫下大豆幼苗的光合特性、离子含量及Na^+动态平衡相关基因表达变化。【结果】150 mmol·L^(-1) Na Cl不同程度地抑制了4种大豆幼苗生长,同时显著降低SPAD值、净光合速率、气孔导度和蒸腾速率,但是Na Cl胁迫对盐敏感大豆影响程度显著高于耐盐品种;盐胁迫显著降低耐盐大豆的胞间CO2浓度,而盐敏感大豆与之相反,说明150 mmol·L^(-1) Na Cl处理下气孔限制是引起耐盐品种光合速率下降主要因素,而盐敏感品种光合速率下降主要因素是非气孔限制。对大豆植株的不同离子含量进行测定,发现盐胁迫下4种大豆叶片中Na^+积累均显著升高,盐敏感品种上升幅度显著高于耐盐品种,而K^+含量与Na^+含量的变化规律相反。盐敏感大豆叶片中磷含量(P)均受盐胁迫显著下降,而耐盐大豆叶片P在胁迫后略有增加。相关分析表明净光合速率变化幅度与叶片中Na^+、K^+和P含量变化幅度存在显著的相关性。对6个参与大豆植株体内Na^+动态平衡相关基因Gm SOS1、Gm Ncl1、Gm SALT3、Gm NHX1(离子通道基因)、Gm CIPK1(信号转导基因)和Gm AVP1(能量运输相关基因)相对表达量进行分析,发现盐胁迫后4种大豆的Gm Ncl1表达量均显著上调,盐敏感品种上调倍数高于耐盐大豆品种,这种表达变化与大豆的耐盐性具有一定的关联性,而其他5个基因表达量与大豆的耐盐性没有明显的关联性。【结论】与盐敏感大豆相比,耐盐大豆在盐胁迫环境条件下减少Na^+在叶片中的积累,保持相对较高的K^+和P含量,并维持相对较高的光合速率,这是耐盐大豆比盐敏感大豆具有较强耐盐特性的因素之一,另外Na^+动态平衡相关基因GmNcl1可能与大豆耐盐特性有一定关联性。

棉花干旱诱导MYB类转录因子GhRAX3的功能分析

【目的】挖掘、分析响应干旱诱导的MYB转录因子的功能,为棉花抗旱研究和育种提供参考。【方法】以已知受干旱诱导表达的Gb MYB5为检索项,BLASTX检索NCBI的非冗余蛋白nr数据库中与Gb MYB5具有相似序列的棉花MYB转录因子,通过荧光定量PCR验证获得干旱应答相关的MYB转录因子Gh RAX3。将Gh RAX3-GFP融合蛋白表达载体通过农杆菌注射法在烟草叶片瞬时表达,观察亚细胞定位荧光信号。将棉花曲叶病毒CLCr V介导的基因沉默载体CLCr V﹕Gh RAX3通过农杆菌浸润法注射棉花子叶,荧光定量PCR检测棉花Gh RAX3表达水平,对Gh RAX3沉默的棉花植株进行干旱胁迫处理,观察表型变化,并检测其叶片失水率、叶片含水量、总抗氧化物酶活性、丙二醛含量和离子渗透率等抗旱相关生理指标。【结果】BLASTX检索结果发现,与Gb MYB5相比,Gh RAX3覆盖率达38%,与Gb MYB5有79%的相似性,编码一个R2R3-MYB转录因子。Gh RAX3响应干旱诱变表达,在18%(v/v)PEG 6000诱导处理0.5 h后即显著上调表达5倍,在48 h后达上调表达33倍。亚细胞定位结果显示Gh RAX3-GFP4融合蛋白仅在细胞核有明显的绿色荧光信号,表明Gh RAX3定位在细胞核中。CLCr V病毒诱导Gh RAX3沉默后,Gh RAX3在沉默株的表达量仅为野生型的41%,表明Gh RAX3表达已被抑制。取干旱处理前的棉花植株同部位的叶片,测定单位重量叶片在0—7 h内的失水量,发现Gh RAX3沉默植株的叶片失水率显著高于野生型和空载体对照植株。在18%(v/v)PEG 6000水溶液处理24 h或在自然干旱15 d后,Gh RAX3沉默的棉花植株萎蔫程度比野生型和空载体对照植株严重。自然干旱处理7 d后,检测叶片含水量、总抗氧化物酶活性、丙二醛含量和离子渗透率等抗旱相关生理指标,发现Gh RAX3沉默植株的叶片相对含水量为82%,总抗氧化物酶活性为1.29 U·mg-1,而野生型和空载体对照植株的叶片相对含水量则分别为89%和91%,总抗氧化物酶活性分别为3.44和3.19 U·mg-1,Gh RAX3沉默植株的叶片相对含水量和总抗氧化物酶活性都显著低于野生型和空载体对照植株;相反,Gh RAX3沉默植株叶片的离子渗漏率为78.54%,丙二醛含量为74.20 nmol·mg-1 FW,而野生型和空载体对照植株叶片的离子渗漏率分别为44.98%和47.45%,丙二醛含量分别为44.90和47.29 nmol·mg-1 FW,Gh RAX3沉默植株叶片的离子渗漏率和丙二醛含量均显著高于野生型和空载体对照。【结论】Gh RAX3响应干旱胁迫诱导,抑制Gh RAX3表达致使棉花在干旱胁迫条件下的叶片相对含水量和总抗氧化物酶活性显著降低,叶片离子渗漏率和丙二醛含量显著升高,使棉花耐干旱胁迫能力下降。

大豆转录因子基因GmMYB111的克隆及功能分析

【目的】克隆大豆MYB转录因子基因,进行序列分析和表达模式分析,并对其功能进行鉴定。【方法】通过对盐胁迫相关的数字表达谱(DGEP)数据分析,获得一个MYB转录因子Gm MYB111;以盐胁迫处理的c DNA为模板,利用RT-PCR法分离克隆MYB基因c DNA编码序列;根据Gm MYB111蛋白序列进行同源性搜索,得到与Gm MYB111蛋白序列相似度较高的其他物种的蛋白序列;使用MEGA5.05对Gm MYB111蛋白序列及其同源序列进行多序列比对分析并构建同源物种间系统进化树;利用实时荧光定量PCR方法检测目的基因在大豆中受非生物胁迫诱导表达情况及组织特异性表达情况;利用拟南芥原生质体转化体系分析Gm MYB111的亚细胞定位情况;通过酵母杂交系统检测其转录激活活性以及体外结合活性。【结果】根据前期江苏省农业科学院农业生物技术研究所盐土农业研究室盐胁迫相关的数字表达谱(DGEP)数据获得盐胁迫响应显著上调(27倍)的Gm MYB111,利用RT-PCR方法从栽培大豆根组织中克隆该基因片段,序列比对发现其与已公布的Williams82基因组数据库序列一致,生物信息学分析表明,其编码的氨基酸序列具有MYB类转录因子的共同特征,其N端具有R2、R3两个MYB结构域,同时其C-端还存在一个富含酸性氨基酸的转录激活区;系统进化树分析表明,该基因编码的蛋白与Gm MYB76、Gm MYB12a以及苜蓿Mt MYB61的亲缘关系最近;Gm MYB111在大豆中的表达受高盐、干旱、冷害和ABA诱导表达,实时荧光定量PCR检测结果显示,在高盐和冷害胁迫下,Gm MYB111呈上调表达,在干旱胁迫诱导后呈先上调后下调的表达模式,在ABA诱导下其表达量呈现波动式上调和下调表达;时空表达分析表明,Gm MYB111为组成型表达,在大豆幼苗期和成熟期的表达量相对较强,成熟期的表达量相对较低,从不同组织来看,Gm MYB111在茎、叶和花中表达量最高,在根中表达量相对较低,在豆荚中不表达;亚细胞定位结果显示Gm MYB111定位于细胞核中,为典型的转录因子;酵母杂交系统检测表明,Gm MYB111具有转录激活功能,并且能够与顺式作用元件TAACTG基序相结合。【结论】Gm MYB111为典型的R2R3-MYB转录因子基因,具有转录激活活性及DNA结合活性,在大豆中的表达可能与大豆的非生物胁迫和ABA信号转导途径有关,推测其可能通过调节下游基因的表达来调控大豆对非生物胁迫的应答。

玉米YABBY基因家族的全基因组鉴定与分析

YABBY基因家族作为植物特有的转录因子家族,在调控植物侧生器官发育中发挥重要作用。本研究利用玉米全基因组数据分析玉米YABBY基因家族,阐明该基因家族成员结构、系统进化发育关系以及基因家族成员在玉米不同组织及不同发育时期的表达谱。结果显示,玉米参考基因组中存在13个YABBY基因,命名为Zm YABBY1~Zm YABBY13,根据系统发育关系和序列相似性将该基因家族分为4亚类S1~S4。RNAseq数据显示玉米YABBY基因在籽粒、茎和茎端分生组织（Shoot apical meristem,SAM）、幼胚及叶片中有较高表达,预示玉米YABBY基因可能在上述器官发育中发挥调控作用。本研究结果为进一步解析该基因家族的功能奠定了研究基础。

小麦茎基腐病菌鉴定及不同药剂防治效果分析

近年来,随着小麦种植主产区赤霉病的频繁发生,由禾谷镰刀菌引起的小麦茎基腐病逐年加重,已经成为小麦生产的潜在威胁。为降低小麦茎基腐病的危害,对田间采集小麦茎基腐病样品进行病原菌分离培养,采用分子细胞观察等分子技术进行鉴定,确定致病菌主要为禾谷镰刀菌。采用不同药剂分别在苗期和返青期防控该病,结果表明,不同药剂对茎基腐病防效存在明显差异,试验药剂中戊唑醇·咪鲜胺合剂、多·酮合剂防效较好,戊唑醇、苯甲丙环唑等单剂也有较好的防效。小麦播种时药剂拌种可显著降低苗期茎基腐病发病率,返青拔节期茎基部喷药具有更好的防效,该结果对生产上防控小麦茎基腐病具有实践意义。

玉米氮素敏感性差异自交系的表达谱分析

玉米基因型的氮肥敏感性存在显著差异,但基因表达模式尚不清楚。本研究以玉米氮敏感型自交系B73和钝感型自交系Mo17为材料,对足氮(sufficient nitrogen,SN)和低氮(limiting nitrogen,LN)条件下苗期叶片组织的转录组进行了分析。对于叶片总氮含量,敏感型B73在足氮和低氮条件下存在显著差异,而钝感型Mo17的差异小且不显著。基因表达差异分析显示,Mo17在2种氮环境下差异基因达13 867个,在低氮环境下上调基因是数下调基因数的1.9倍(9044/4823);B73差异基因数为10 028个,低氮环境下上调基因少于下调基因数(4233/5795)。基因聚类分析也显示,低氮环境下钝感型Mo17基因表达上调或下调的幅度高于敏感型B73。差异基因双尾方差分析表明,受氮环境和基因型共同影响的差异基因为342个,功能主要集中在与氨基酸代谢、光合作用、次级代谢及基因复制表达等途径。综上所述,在低氮条件下氮钝感型Mo17较敏感型B73激活更多的基因来提高植株对氮的吸收和同化能力,被激活的基因可能与玉米氮肥同化和利用有关。

高粱不同组织浸提液对小麦幼苗的化感作用

为了给小麦合理轮作倒茬提供参考依据,研究了高粱不同组织的水浸提液对小麦幼苗生长的化感作用。结果表明,高粱秆、穗、叶的水浸提液对小麦幼苗的苗高和根长均有极强的化感作用,浸提液在低浓度时促进小麦生长,高浓度抑制小麦生长,且对根的化感作用大于对地上部的化感作用。高浓度高粱浸提液降低了小麦的根系活力和叶片可溶性蛋白含量,提高了小麦叶片的丙二醛(MDA)含量;小麦叶片的超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)、过氧化物酶(POD)等酶活性均显著下降。综合来看,高粱不同组织水浸提液对小麦的化感作用表现为秆>穗>叶。

玉米自交系的遗传多样性分析及杂种优势群划分

收集具有丰富遗传多样性的种质资源是玉米育种的前提,通过对资源进行杂种优势群的划分可以显著提高育种效率。本研究利用135对InDel分布在玉米10条染色体上的分子标记引物,系统分析了491份玉米自交系的遗传多样性,结果显示标记多态性信息量变化范围为0.255-0.678。通过计算遗传相似值（GS）,上述材料被划分成8个包括Reid群、Lancaster群、四平头群和PB群的杂种优势群。本研究结果为组配优良玉米杂交种提供了遗传信息。

一个棉花类受体蛋白激酶基因的克隆与表达分析

利用简并引物扩增、染色体步移以及RT-PCR的方法,分离了棉花的一个类受体蛋白激酶基因的全长序列。序列分析表明,该基因没有内含子,开放读码框的长度为2964 bp,编码的多肽序列含有988个氨基酸并与拟南芥控制花器官脱落的基因HAESA-like2具有60%左右的相似性,将该基因命名为GRLK5。半定量RT-PCR分析发现GRLK5在种子、茎皮、根和纤维中的表达量较高,并且受ABA的诱导表达。将GRLK5整合到植物表达载体pCAMBIA2301中,构建植物过量表达载体,通过农杆菌介导,采用叶盘法转化烟草,PCR检测证明目的基因已经整合到烟草基因组中。

棉花SUPERMAN类锌指蛋白基因GZFP的启动子及功能分析

GZFP是来源于陆地棉的一个SUPERMAN类锌指蛋白基因。为了进一步了解该基因功能,本研究通过染色体步移(Genome walking)获得其启动子区域,并构建该片段与GUS连接的重组载体pBI-pGZFP-5::GUS,通过花浸染法转化拟南芥。转基因植株的GUS染色结果表明GUS基因主要在根部以及花器官表达,而叶片中的表达量很低,并且根部的表达量在整个生育期都很强。通过半定量RT-PCR分析不同诱导下GZFP基因的表达变化,发现ABA、干旱、盐胁迫诱导可以提高其表达量。构建GZFP过量表达载体并通过叶盘法转化烟草,烟草转化株的表型无明显变化,但是转化株中NtOPBP1和NtERD10的表达量较未转化株明显增强,而这两个基因都参与了植物的抗逆反应,说明GZFP基因可能与植物抗逆相关。

大豆GmNAC8基因克隆与原核表达

为了进一步明确GmNAC8基因的功能,设计带有Nde I和Xba I双酶切位点引物,从大豆根系cDNA中克隆到GmNAC8基因全长ORF(Open reading frame),编码蛋白质分子质量为37 000,理论等电点为6.43。将扩增片段克隆至原核表达载体pCZN1,构建重组质粒pCZN1-GmNAC8,经过酶切和PCR验证,并转化至大肠杆菌BL21(DE3)中,0.2 mmol/L IPTG诱导后,经SDS-PAGE电泳检测获得了目的蛋白质,该蛋白质主要以包涵体的形式存在,通过镍柱子纯化获得纯化蛋白质,然后利用His标签蛋白质作为抗体进行Western-blot分析,证明所纯化蛋白质为目的蛋白质。

12份蕨类材料亲缘关系的SSR分析

利用SSR分子标记技术对12份蕨类材料进行亲缘关系分析。结果表明，从180对引物中筛选出15对多态性高、重复性好的引物，对12份蕨类材料基因组DNA进行扩增，共扩增出117条带，其中多态性带98条，平均每对引物产生6．53条多态性带，多态性比例为83．76％。通过NTSYS—pc2．10e软件计算不同蕨类材料之间的遗传相似系数，并进行聚类分析。遗传分析表明，12份材料间的遗传相似系数为0．351～0．857，且聚类分析表明，遗传相似系数在0．61—0．63可将供试材料分为3个类群。应用SSR分子标记技术能较准确地分析蕨类不同材料之间的亲缘关系及遗传多样性。

玉米二态性InDel位点的鉴定和分子标记开发

随着下一代测序技术(Next generation sequencing,NGS)的发展,可以利用高通量测序数据挖掘基因组特异的插入/缺失(In Del)位点,这使In Del分子标记的开发成为可能。本研究利用327份玉米自交系的测序数据,通过全基因组结构变异评估发现分布于10条染色体上的25 847个In Del位点。利用PIC值≥0.30的3 304个位点进行系统发育树构建和群体结构分析,其结果与利用SNP位点分析获得的结果高度一致,说明这些多态性较高的In Del位点可以作为代表性标记用于玉米遗传组成的差异分析。采用53对PCR引物进行扩增试验,发现这些In Del引物具有位点专化特征并且其杂交种鉴定的平均杂合率为0.569 2,表明这些标记能准确鉴定出玉米杂交种的杂合度。

沿海滩涂油葵种植与鸟害调查分析

对油葵不同生育期、周边环境以及盘面形状、曲度、直径等籽盘性状与鸟害的关系进行了统计分析。结果表明:在油葵全生育期中,鸟害对油葵的危害以籽实成熟后到采收期间最为突出和严重,对产量造成的损失为11.19%,其中以麻雀为主;周边环境与鸟害程度紧密相关,靠近雀鸟栖息地的地带是鸟害最为严重的区域,产量损失高达29.43%,远高于同一地块旁侧区域,从栖居地到田块最近的直线是雀鸟取食的主路径,因反复取食而危害最重;外翻型的籽盘受雀鸟危害最重,达20.91%,平整型和内收型的籽盘鸟害损失较轻,与前者相比存在显著性差异;盘面曲度小于45 mm时,鸟害损失明显降低。综合分析认为,沿海滩涂种植油葵应在葵盘背部发黄时及时采收,种植场地应选择宽阔、远离茂密树林的地块。