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GDF9和FST调控猪卵母细胞成熟和胚胎早期发育
被引量:
11
1
作者
彭中友
孙俊铭
+3 位作者
李燕
刘庆友
于建宁
施振旦
《江苏农业学报》
CSCD
北大核心
2015年第3期583-589,共7页
为探讨生长分化因子9(Growth differentiation factor 9,GDF9)和卵泡抑素(Follistatin,FST)如何影响猪卵母细胞成熟及胚胎早期发育能力,在猪卵母细胞体外成熟(IVM)培养过程中添加不同浓度的GDF9和抗GDF9抗体,或同时添加GDF9和FST或抗FS...
为探讨生长分化因子9(Growth differentiation factor 9,GDF9)和卵泡抑素(Follistatin,FST)如何影响猪卵母细胞成熟及胚胎早期发育能力,在猪卵母细胞体外成熟(IVM)培养过程中添加不同浓度的GDF9和抗GDF9抗体,或同时添加GDF9和FST或抗FST抗体,测定猪卵母细胞的细胞核成熟率、卵裂率、囊胚率及囊胚总细胞数。结果显示,添加GDF9显著提高孤雌胚囊胚率,抗GDF9抗体则显著抑制卵裂率和囊胚率。添加FST显著降低孤雌胚囊胚率和囊胚总细胞数,添加抗FST抗体显著提高了囊胚率。共同添加GDF9与抗FST抗体则使囊胚率达到最高。表明猪卵母细胞IVM期添加GDF9能一定程度上提高卵母细胞及胚胎的发育能力,共同添加GDF9和抗FST抗体对胚胎发育的促进作用具有加性效应。
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关键词
猪
GDF9
抗GDF9抗体
抗FST抗体
囊胚率
卵母细胞发育能力
下载PDF
职称材料
不同来源β-酪蛋白基因启动子调控人IFNα-2b基因的表达效率
2
作者
李辉
刘庆友
石德顺
《中国农业科学》
CAS
CSCD
北大核心
2016年第5期970-978,共9页
【目的】为获得高启动效率的乳腺特异启动子,对荷斯坦奶牛、娟姗牛和奶水牛的β-酪蛋白基因启动子进行比较研究。【方法】对Genbank中所收录的荷斯坦奶牛、娟姗牛和水牛β-酪蛋白基因启动子序列进行比对分析,按照保守序列分别设计启动...
【目的】为获得高启动效率的乳腺特异启动子,对荷斯坦奶牛、娟姗牛和奶水牛的β-酪蛋白基因启动子进行比较研究。【方法】对Genbank中所收录的荷斯坦奶牛、娟姗牛和水牛β-酪蛋白基因启动子序列进行比对分析,按照保守序列分别设计启动子区和3′端ploy A序列引物,同时设计人IFNα-2b基因和EGFP-Neo筛选序列引物并引入预先设计的酶切位点以方便载体构建。采集静脉血液,提取基因组DNA。PCR克隆β-酪蛋白基因启动子区和3′端ploy A区,同时以实验室保存质粒为模板克隆人IFNα-2b基因和EGFP-Neo筛选序列。测序正确后,将各片段按设计顺序依次插入p MD18-T骨架中,构建成p HSTBCNp-IFN,p JSBCNp-IFN和p SNBCNp-IFN乳腺特异表达载体。将各载体转染Bcap-37细胞,经G418筛选出稳定整合的转基因细胞系。用胰岛素(1 mg·L-1),转铁蛋白因子(1 mg·L-1),氢化可的松(1 mg·L-1)和PRL(250IU·L-1)联合对转基因细胞系进行诱导,然后用PCR、Western blotting、QRT-PCR技术和ELISA方法分别在m RNA水平和蛋白质水平检测IFNα-2b的表达。【结果】PCR后获得了荷斯坦奶牛、娟姗牛和水牛β-酪蛋白基因启动子区,长度分别为5 219、5 244和5 216 bp,其中包括了第一外显子,第一内含子和部分第二外显子,部分第二外显子的51个碱基编码17个氨基酸的信号肽序列。克隆了1 166 bp的ploy A区序列。最终将构建的3个乳腺特异表达载体转染Bcap-37细胞并经过G418筛选后,获得了3个转基因细胞系。经激素诱导后,PCR、Western blotting、QRT-PCR和ELISA检测发现3个转基因细胞系都表达了IFNα-2b基因,并且发现娟姗牛β-酪蛋白基因启动子在调控IFNα-2b基因的表达上效率较高,在m RNA水平和蛋白质水平上显著高于其他两个启动子(P<0.05)。【结论】娟姗牛β-酪蛋白基因启动子在调控外源基因表达上具有较高的效率,是具有应用前景的乳腺特异性启动子。所构建的表达载体为IFNα-2b转基因动物乳腺生物反应器的制备奠定基础。
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关键词
启动子
娟姗牛
干扰素Α-2B
BCAP-37
转基因
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职称材料
一种优化的猪卵泡颗粒细胞分离方法及验证
被引量:
1
3
作者
曲小露
施振旦
李辉
《江苏农业科学》
2019年第23期190-194,共5页
目前,进行体外研究的卵泡颗粒细胞主要通过抽取卵泡液的方式获得。而笔者前期研究发现,通过该方式获得的颗粒细胞贴壁率低且活力差。为解决该问题,在抽取方式的基础上采用FICOLL-Paque分离液对细胞进行进一步纯化,并通过CCK-8、WesternB...
目前,进行体外研究的卵泡颗粒细胞主要通过抽取卵泡液的方式获得。而笔者前期研究发现,通过该方式获得的颗粒细胞贴壁率低且活力差。为解决该问题,在抽取方式的基础上采用FICOLL-Paque分离液对细胞进行进一步纯化,并通过CCK-8、WesternBlot、免疫荧光染色、QRT-PCR、ELISA等方法分别对纯化细胞的形态、增殖能力、激素分泌相关受体(FSHR、LHCGR)和基因(CYP19A1、CYP11A1、StAR)的表达及激素分泌情况进行检测。结果发现,经纯化的细胞贴壁能力、细胞形态和增殖能力明显改善,且各激素分泌相关基因都有表达;E2分泌量明显提高,而P4分泌明显降低。研究结果表明,经FICOLL-Paque分离液纯化后的猪卵泡颗粒细胞中黄体化的颗粒细胞被大部分清除,纯化后的细胞活力更好且更能体现出颗粒细胞的特性。
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关键词
颗粒细胞
FICOLL-Paque
细胞增殖
孕酮
免疫荧光染色
FSH受体
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职称材料
题名
GDF9和FST调控猪卵母细胞成熟和胚胎早期发育
被引量:
11
1
作者
彭中友
孙俊铭
李燕
刘庆友
于建宁
施振旦
机构
江苏省农业科学院畜牧研究所/动物品种改良与繁育重点实验室
贵州省
畜牧
兽医学校
广西大学
动物
科学
学院
出处
《江苏农业学报》
CSCD
北大核心
2015年第3期583-589,共7页
基金
江苏省农业科技自主创新基金项目[CX(11)4074]
国家科技支撑计划项目(2011BAD19B02-6)
文摘
为探讨生长分化因子9(Growth differentiation factor 9,GDF9)和卵泡抑素(Follistatin,FST)如何影响猪卵母细胞成熟及胚胎早期发育能力,在猪卵母细胞体外成熟(IVM)培养过程中添加不同浓度的GDF9和抗GDF9抗体,或同时添加GDF9和FST或抗FST抗体,测定猪卵母细胞的细胞核成熟率、卵裂率、囊胚率及囊胚总细胞数。结果显示,添加GDF9显著提高孤雌胚囊胚率,抗GDF9抗体则显著抑制卵裂率和囊胚率。添加FST显著降低孤雌胚囊胚率和囊胚总细胞数,添加抗FST抗体显著提高了囊胚率。共同添加GDF9与抗FST抗体则使囊胚率达到最高。表明猪卵母细胞IVM期添加GDF9能一定程度上提高卵母细胞及胚胎的发育能力,共同添加GDF9和抗FST抗体对胚胎发育的促进作用具有加性效应。
关键词
猪
GDF9
抗GDF9抗体
抗FST抗体
囊胚率
卵母细胞发育能力
Keywords
FST
porcine
anti-GDF9 antibody
follistatin
anti-follista-tin antibody
blastocyst rate
oocyte developmental compe-tence
分类号
S828 [农业科学—畜牧学]
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职称材料
题名
不同来源β-酪蛋白基因启动子调控人IFNα-2b基因的表达效率
2
作者
李辉
刘庆友
石德顺
机构
广西大学
动物
科学
技术
学院
/亚热带
农业
生物资源保护与利用国家
重点
实验室
江苏省农业科学院畜牧研究所/动物品种改良与繁育重点实验室
出处
《中国农业科学》
CAS
CSCD
北大核心
2016年第5期970-978,共9页
基金
国家"863"项目(2011AA100607)
国家转基因专项(2014ZX08007001-002)
文摘
【目的】为获得高启动效率的乳腺特异启动子,对荷斯坦奶牛、娟姗牛和奶水牛的β-酪蛋白基因启动子进行比较研究。【方法】对Genbank中所收录的荷斯坦奶牛、娟姗牛和水牛β-酪蛋白基因启动子序列进行比对分析,按照保守序列分别设计启动子区和3′端ploy A序列引物,同时设计人IFNα-2b基因和EGFP-Neo筛选序列引物并引入预先设计的酶切位点以方便载体构建。采集静脉血液,提取基因组DNA。PCR克隆β-酪蛋白基因启动子区和3′端ploy A区,同时以实验室保存质粒为模板克隆人IFNα-2b基因和EGFP-Neo筛选序列。测序正确后,将各片段按设计顺序依次插入p MD18-T骨架中,构建成p HSTBCNp-IFN,p JSBCNp-IFN和p SNBCNp-IFN乳腺特异表达载体。将各载体转染Bcap-37细胞,经G418筛选出稳定整合的转基因细胞系。用胰岛素(1 mg·L-1),转铁蛋白因子(1 mg·L-1),氢化可的松(1 mg·L-1)和PRL(250IU·L-1)联合对转基因细胞系进行诱导,然后用PCR、Western blotting、QRT-PCR技术和ELISA方法分别在m RNA水平和蛋白质水平检测IFNα-2b的表达。【结果】PCR后获得了荷斯坦奶牛、娟姗牛和水牛β-酪蛋白基因启动子区,长度分别为5 219、5 244和5 216 bp,其中包括了第一外显子,第一内含子和部分第二外显子,部分第二外显子的51个碱基编码17个氨基酸的信号肽序列。克隆了1 166 bp的ploy A区序列。最终将构建的3个乳腺特异表达载体转染Bcap-37细胞并经过G418筛选后,获得了3个转基因细胞系。经激素诱导后,PCR、Western blotting、QRT-PCR和ELISA检测发现3个转基因细胞系都表达了IFNα-2b基因,并且发现娟姗牛β-酪蛋白基因启动子在调控IFNα-2b基因的表达上效率较高,在m RNA水平和蛋白质水平上显著高于其他两个启动子(P<0.05)。【结论】娟姗牛β-酪蛋白基因启动子在调控外源基因表达上具有较高的效率,是具有应用前景的乳腺特异性启动子。所构建的表达载体为IFNα-2b转基因动物乳腺生物反应器的制备奠定基础。
关键词
启动子
娟姗牛
干扰素Α-2B
BCAP-37
转基因
Keywords
promoter
Jersey Cow
interferon α-2b
Bcap-37
transgene
分类号
S823 [农业科学—畜牧学]
下载PDF
职称材料
题名
一种优化的猪卵泡颗粒细胞分离方法及验证
被引量:
1
3
作者
曲小露
施振旦
李辉
机构
吉林
农业
大学
动物
科技
学院
江苏省农业科学院畜牧研究所/动物品种改良与繁育重点实验室
出处
《江苏农业科学》
2019年第23期190-194,共5页
基金
国家自然科学基金(编号:31402080)
江苏省自然科学基金(编号:BK20151365)
文摘
目前,进行体外研究的卵泡颗粒细胞主要通过抽取卵泡液的方式获得。而笔者前期研究发现,通过该方式获得的颗粒细胞贴壁率低且活力差。为解决该问题,在抽取方式的基础上采用FICOLL-Paque分离液对细胞进行进一步纯化,并通过CCK-8、WesternBlot、免疫荧光染色、QRT-PCR、ELISA等方法分别对纯化细胞的形态、增殖能力、激素分泌相关受体(FSHR、LHCGR)和基因(CYP19A1、CYP11A1、StAR)的表达及激素分泌情况进行检测。结果发现,经纯化的细胞贴壁能力、细胞形态和增殖能力明显改善,且各激素分泌相关基因都有表达;E2分泌量明显提高,而P4分泌明显降低。研究结果表明,经FICOLL-Paque分离液纯化后的猪卵泡颗粒细胞中黄体化的颗粒细胞被大部分清除,纯化后的细胞活力更好且更能体现出颗粒细胞的特性。
关键词
颗粒细胞
FICOLL-Paque
细胞增殖
孕酮
免疫荧光染色
FSH受体
分类号
S828.3 [农业科学—畜牧学]
下载PDF
职称材料
题名
作者
出处
发文年
被引量
操作
1
GDF9和FST调控猪卵母细胞成熟和胚胎早期发育
彭中友
孙俊铭
李燕
刘庆友
于建宁
施振旦
《江苏农业学报》
CSCD
北大核心
2015
11
下载PDF
职称材料
2
不同来源β-酪蛋白基因启动子调控人IFNα-2b基因的表达效率
李辉
刘庆友
石德顺
《中国农业科学》
CAS
CSCD
北大核心
2016
0
下载PDF
职称材料
3
一种优化的猪卵泡颗粒细胞分离方法及验证
曲小露
施振旦
李辉
《江苏农业科学》
2019
1
下载PDF
职称材料
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