转基因作物对土壤微生物多样性影响研究技术的进展

土壤微生物的多样性是保持农业生态系统稳定的基础,而作物的改变对土壤微生物的多样性结构具有显著的影响。转基因作物被引入到农田后所带来的微生物群落变化及对农业生态系统所带来的不确定因素,已成为研究热点。本文着重介绍了当前土壤微生物多样性研究中常用的3种基于16S rDNA的技术:变性梯度凝胶电泳(DGGE)、扩增性核糖体DNA限制酶切片段分析(ARDRA)和末端限制性酶切片段长度多态性(T-RFLP)技术,分析比较了各种技术的原理、优点及其应用局限性,并简短综述了这些技术近年来的应用。

亲和短肽用于快速检测转基因蛋白Cry3Bb

本研究利用竞争洗脱法淘选与Cry3Bb毒素具有亲和力的特异性短肽,以此建立间接竞争酶联免疫吸附检测方法(IC-ELISA)。经过4轮淘选、富集,获得与靶蛋白具有较高亲和力的B10克隆(ACIHSPTALCGGG)。所建立的检测方法稳定性较好,变异系数在5%以内;线性检测范围为0.03~29.95μg/ml,线性回归方程为(Y=20.044x+50.407,R2=0.983 4),检测限为0.009 6μg/ml,在玉米样品中提取回收率为92.26%~101.22%。本研究所建立的ELISA检测方法为粮食中Cry3Bb蛋白的定量检测提供了有效的手段,在转基因产品的检验检疫中有较高的应用价值。

4种有机磷农药DNA适体的筛选及结构分析

利用SELEX技术从一个固定的随机ssDNA库中同时筛选甲拌磷、丙溴磷、水胺硫磷、氧化乐果4种有机磷农药的DNA适体。随着筛选轮数的增加,4种有机磷农药从固定的随机库中洗脱的ssDNA逐渐富集,经过12轮的筛选,筛选效率达到40.8%。对第12轮洗脱的ssDNA进行克隆、测序,挑选的15个阳性克隆均测序成功,由于部分克隆具有完全一致的序列,最终筛选到5条ssDNA序列。一级结构序列分析表明5条ssDNA具有一定的同源性,二级结构预测表明5条ssDNA的二级结构主要以茎环结构为主,表明茎环结构可能是适体结合4种有机磷农药的基础。

Cry2Aa毒素结合十二肽的筛选与鉴定

利用Cry-2Aa毒素蛋白对噬菌体展示随机十二肽库进行4轮筛选，并从第4轮筛选产物中随机挑选20个单克隆，进行单克隆ELISA、PCR扩增、DNA电泳及测序，鉴定这些克隆与Cry2Aa毒素的结合活性。结果显示，这20个克隆均能与c巧也Aa毒素发生特异性结合，并推导出8条不同的序列。挑取阳性值最高的克隆GT（氨基酸序列为GTPWHHHRHLIV）建立了基于十二肽的Cry-2Aa毒蛋白的间接竞争ELISA检测方法。该方法的抑制中浓度（IC50）为1｜1390μg／ml，最低检测限IC10为O．0211μg／ml，线性检测范围为0．0478～22.691Oμg／ml（Y=23．09lgx＋48．692，R^2=0．9963）。噬菌体展示肽库筛选方法为快速、准确地检测Cry2Aa毒蛋白提供了新的途径。