表观基因组学研究方法进展与评价

表观遗传学是指基于非基因序列改变所致基因表达水平的变化,如DNA甲基化和组蛋白修饰等;表观基因组学则是在基因组水平上对表观遗传学改变的研究。DNA甲基化已经成为表观遗传学和表观基因组学的重要研究内容,人类表观基因组计划的最终目标是绘制出人类基因组中甲基化可变位点图谱。随着研究的不断深入,各种研究方法被开发出来以满足不同类型研究的需要。文章主要介绍目前已有的表观基因组学研究方法,并对其进行简要分析和总结。

细胞凋亡反应中NOXA基因启动子发挥增强子功能调节BCL2基因表达

真核生物基因的转录受到近端启动子和远端增强子的共同调控,部分基因的启动子可兼具有增强子的活性。NOXA与BCL2分别是BCL2蛋白家族促凋亡和抗凋亡成员。本课题组前期研究发现,NOXA基因启动子与BCL2基因启动子在染色质三维空间结构上存在相互作用,且NOXA基因启动子区兼有启动子和增强子特征性的组蛋白修饰标记。为进一步探究NOXA启动子是否具有增强子活性、能否在细胞凋亡过程中作为增强子调控BCL2基因表达,本研究利用染色质构象捕获(chromosome conformation capture,3C)、实时荧光定量PCR(quantitative real-time PCR,qRT-PCR)和荧光素酶报告基因等检测技术在喜树碱诱导的MCF-7细胞凋亡模型中证实,NOXA启动子兼具增强子活性,并可通过形成染色质环结构远程调控BCL2基因表达。NOXA启动子的调控属性与凋亡信号强弱密切相关,在较弱凋亡信号刺激下(1μmol/L喜树碱处理),NOXA启动子主要发挥增强子功能;随着凋亡刺激信号的加强(10μmol/L喜树碱处理),NOXA启动子活性增强,主要调控其基因自身的表达,促进细胞凋亡。染色质免疫共沉淀(chromatin immunoprecipitation,ChIP)证实NOXA启动子区启动子活性和增强子活性的动态变化与其组蛋白修饰标志一致。本研究为进一步探讨BCL2家族成员对细胞凋亡刺激做出协同反应的机制提供了新的线索。

小鼠PNPLA7敲降重组腺病毒的构建及其生物学功能的初步研究

目的:构建小鼠PNPLA7基因的敲降重组腺病毒,检测PNPLA7敲降重组腺病毒对小鼠肝脏PNPLA7蛋白的敲降效率及对肝脏甘油三酯含量的影响。方法:将对照si NC以及敲降PNPLA7的siRNA设计为shRNA并插入到pshuttle-CMV-silence穿梭质粒中,挑选克隆并测序鉴定,测序成功后将质粒进行PmeⅠ线性化,转入含有腺病毒骨架p Adeasy的BJ5183感受态细胞中进行同源重组,重组成功后的质粒经PacⅠ线性化转染293A细胞进行腺病毒包装,得到Ad-sh NC对照腺病毒以及AdshPNPLA7敲降腺病毒。通过尾静脉注射腺病毒7 d后根据免疫印迹实验检测小鼠肝脏中PNPLA7敲降效率,同时利用Folch提脂方法提取并检测小鼠肝脏中甘油三酯含量。结果:成功获得对照腺病毒Ad-shNC以及敲降腺病毒Ad-shPNPLA7。通过尾静脉注射进行小鼠肝脏PNPLA7敲降,结果显示Ad-shPNPLA7腺病毒可成功降低PNPLA7的蛋白表达,敲降PNPLA7后引起肝脏甘油三酯含量上调。结论:小鼠PNPLA7的敲降腺病毒构建成功,敲降PNPLA7引起肝脏中甘油三酯含量升高。

转基因水稻胚乳中表达铁结合蛋白提高稻米铁含量

为提高我国稻米的铁含量 ,通过农杆菌介导将自行克隆的菜豆 (Phaseoluslimensis)铁结合蛋白 (Ferritin)基因导入了一个高产粳稻 (OryzasativaL .ssp .japonica)品种中 ,获得 17个独立的转基因水稻株系。分子检测证明 ,外源基因在多数转基因水稻植株基因组中有 1～ 3个整合位点 ,并可稳定遗传。在水稻种子贮存蛋白谷蛋白基因GluB 1启动子的控制下 ,铁结合蛋白基因可在转基因水稻的种子中高效特异地表达 ,不同转化子中的表达量有明显不同。在转基因水稻种子中表达铁结合蛋白后对提高精米中的铁含量有明显的效果 ,相对于未转化对照最多可提高 6 4 % ,而锌的含量并无明显变化。

水稻rbcS启动子控制的外源基因在转基因水稻中的特异性表达

为将不同启动子用于转基因水稻的研究,从武运粳8号水稻中克隆了Rubisco小亚基基因(rbcS)的5'上游调控区,构建了由rbcS启动子引导的GUS融合基因,并经农杆菌介导导入到水稻中。对转基因水稻植株中GUS活性的定性与定量测定结果表明,rbcS启动子可驱动GUS报告基因在转基因水稻植株叶片和叶鞘内的叶肉细胞中特异性高效表达,而在茎、根和种子等器官中不表达或表达活性极弱,表现出明显的组织与细胞特异性。结果还表明,光诱导处理可明显提高rbcS启动子启动的外源基因的表达量。

反义Wx基因导入我国常规籼稻品种的研究

经农杆菌介导,将自行克隆并构建的反义Wx基因导入4个高直链淀粉含量的常规籼稻品种绿黄占、清芦占11号、三芦占7号和特青中,经潮霉素抗性筛选获得抗性植株。聚合酶链反应(PCR)和Southern杂交检测证明反义Wx基因已整合进转基因水稻植株的基因组中。对成熟种子直链淀粉含量的分析表明,部分转基因水稻植株T_1或T_2代种子中的直链淀粉含量有不同程度的下降,最低的已降至16.52％,较对照下降了40.5％;在此基础上筛选获得了部分转基因纯合株系。研究结果还表明,直链淀粉含量的改变会导致相应稻米的胶稠度和糊化温度的变化。

转基因稻谷外源蛋白在肉仔鸡体内的安全评价

为了研究肉仔鸡体内器官中是否存在转基因稻谷所表达的外源蛋白,为转基因水稻品系进一步的饲用或食用安全性研究奠定基础,试验将200只1日龄的AA肉仔鸡随机分成2组,试验组、对照组,分别饲喂转基因稻谷及其亲本配制的基础日粮,采用Western blotting方法对饲喂转基因稻谷及其亲本稻谷种子、饲料及其对应粪便,各组肉仔鸡的胸肌、腿肌、肝脏、肾脏、血液、腺胃、肌胃、十二指肠肠壁、空肠肠壁、回肠肠壁的转基因外源蛋白在肉仔鸡体内的表达情况进行了检测。结果表明:采用Western blotting技术未在肉仔鸡体内各器官中检测到转基因稻谷所转录表达的外源蛋白,转基因蛋白成分能够被机体完全消化,肉仔鸡粪便中未检测到所转录的外源蛋白,转基因蛋白不会通过粪便在自然界传播。

转基因稻谷日粮对肉仔鸡血清生化指标的影响

为了研究转基因稻谷日粮对肉仔鸡血液生化指标的影响,监测转基因稻谷对肉仔鸡健康状况的影响。试验将200只1日龄的肉仔鸡随机分成2组,试验组、对照组分别饲喂转基因稻谷及其亲本配制的基础日粮。21日龄、42日龄时测定试验组与对照组血液生化指标之间的差异。结果表明:饲喂含有转基因稻谷日粮的肉仔鸡在早期可降低碱性磷酸酶含量,降低后期血液中尿酸含量,而对其它血液生化指标无显著影响。转基因稻谷日粮作为肉仔鸡的饲料原料对肉仔鸡血液生化指标未造成负面影响。

转新城疫病毒融合蛋白基因水稻植株的获得

以编码新城疫病毒融合蛋白 (NDV -F)基因为外源基因 ,与玉米泛素蛋白 (Ubi)启动子和农杆菌胭脂碱合成酶基因(NOS)终止子构建成嵌合基因 ,构建了适宜于农杆菌介导转化水稻的表达质粒pUNDV ;并以潮霉素磷酸转移酶 (HPT)基因作选择标记基因、β -半乳糖苷酸酶 (GUS)基因作报告基因 ,借助于农杆菌介导转化水稻 ,获得了多株转基因植株。PCR分析和GUS活性检测结果证实含有NDV -F基因的T -DNA已整合到水稻基因组中。为研制廉价的转基因水稻新城疫基因工程疫苗奠定了基础。

可能参与调节中枢神经系统病变的新的信号分子:JWA基因对HEK293细胞谷氨酸转运的影响

目的:探讨新的微管相关蛋白JWA对谷氨酸转运的调控及其机制。方法:用构建JWA高表达载体转染的HEK293细胞,建立JWA高表达模型;用反义寡核苷酸技术抑制细胞JWA表达,建立JWA低表达模型;用激光共聚焦显微镜检测细胞内Ca2+的含量,用免疫荧光和Westernblot法检测细胞内Jwa蛋白的表达水平。掺入犤3H犦-D,L-谷氨酸为标志物观察JWA基因对细胞摄取谷氨酸的影响。结果:JWA基因高表达的细胞摄取谷氨酸增加;用反义寡核苷酸关闭JWA后,谷氨酸摄取下降。佛波酯可使JWA高表达细胞和对照组未转染细胞谷氨酸转运都增加,但未转染细胞与JWA高表达细胞谷氨酸摄取增加无显著差别。佛波酯还可引起HEK293细胞内游离钙浓度一过性升高。结论:JWA编码的微管相关蛋白可通过非PKC途径增强HEK293细胞谷氨酸转运功能,增强谷氨酸介导的神经兴奋传递,参与中枢神经系统病变,因而是一种可能参与调节中枢神经系统病变的新的信号分子。而佛波酯引起的细胞谷氨酸转运功能增强可能与细胞内钙稳态的改变有关。

新城疫病毒融合蛋白在转基因水稻叶片中的表达及其免疫原性

利用转基因植物作为生物反应器表达抗原蛋白具有广阔的应用前景。以新城疫病毒融合蛋白(NDVF)基因1.7kb全长编码区序列为外源基因与组成型表达的玉米泛素蛋白基因(Ubi)启动子和农杆菌胭脂碱合成酶基因(nos)终止子组成嵌合基因,构建了适宜于农杆菌介导转化水稻的转化载体pUNDV,经根癌农杆菌介导的遗传转化方法将由Ubi启动子驱动的NDVF嵌合基因导入水稻细胞中,经潮霉素抗性筛选,共再生获得了6个独立的转基因株系。PCR分析结果表明NDVF基因已整合到水稻基因组中。ELISA和Westernblot分析结果证实NDVF蛋白在部分转基因水稻叶片组织中获得表达,其中植株F5叶片组织中具有较高的表达水平。将F5叶片可溶性总蛋白皮下注射免疫BALB/c小鼠,结果表明能够诱导小鼠产生一定水平的NDVF蛋白特异抗体。

核因子-κB及Bcl-2基因在肝外胆管癌组织中表达及意义

目的研究核因子κB(NF-κB)及抗凋亡基因Bcl-2在肝外胆管癌组织中的表达及意义。方法应用免疫组织化学SABC法,检测NF-κB在48例肝外胆管癌组织及12例正常肝外胆管组织中的表达变化及抗凋亡基因Bcl-2的相应表达,并分析其与肝外胆管癌临床病理的关系。结果NF-κB在肝外胆管癌组织及正常胆管组织中的阳性表达率分别为75%、16.7%,两者有显著性差异(P<0.01);Bcl-2在肝外胆管癌组织及正常胆管组织中的阳性表达率分别为64.6%、8.3%,两者有显著性差异(P<0.01)。NF-κB的阳性表达在病理分级间有显著性差异(P<0.01)且与Bcl-2的阳性表达显著相关。结论NF-κB是一种与肝外胆管癌有关的癌蛋白,其与Bcl-2高度相关,表明NF-κB可能通过对下游抗凋亡基因表达的调控,参与了肝外胆管癌的抗凋亡过程,影响肝外胆管癌的发生发展。

垂体GH腺瘤GH分泌生化特征及与gsp癌基因表达相关性

目的探讨生长抑素对人垂体生长激素腺瘤生长激素(GH)分泌的效应及其与gsp癌基因的表达相关性。方法收集20例GH腺瘤患者体内注射长效生长抑素(SST)后GH和胰岛素样生长因子-1(IGF-1)的变化,术中切除肿瘤组织进行体外细胞培养后分为SST组和对照组,应用酶联免疫吸附试验(ELISA)检测药物干预后GH的分泌变化。同时提取肿瘤组织DNA检测gsp基因序列。结果在20例肿瘤标本中10例gsp癌基因突变阳性(50%)。SST干预后体内外GH分泌大多受到不同程度抑制,个别表现出刺激效应,但与gsp癌基因表达无统计学相关性。结论短期使用SST对大多数GH腺瘤患者体内和体外均有抑制GH水平作用,少数患者具有天然耐药性。

A类清道夫受体N端第1～27位氨基酸胞浆结构域缺失对功能的影响

目的确定A类清道夫受体胞浆域中的信号序列,探讨其对于受体功能的影响。方法构建A类清道夫受体N端第1～27位氨基酸胞浆结构域缺失体的表达质粒,并将其经脂质体介导瞬时转染入CHO细胞中。用Westernblot检测A类清道夫受体在细胞中的表达,并用流式细胞仪定量检测转染后的蛋白表达效率。用DiI标记的乙酰化低密度脂蛋白与转染的细胞共孵育,激光共聚焦显微镜下观察乙酰化低密度脂蛋白在细胞内的分布,并进行荧光定量分析。结果A类清道夫受体N端第1～27位氨基酸胞浆结构域缺失体可大量表达于转染细胞膜和细胞浆。在高浓度乙酰化低密度脂蛋白刺激下,A类清道夫受体N端第1～27位氨基酸胞浆结构域缺失体的细胞内定位发生变化,也可存在于转染细胞核内。A类清道夫受体N端第1～27位氨基酸胞浆结构域缺失体摄取DiI标记乙酰化低密度脂蛋白的能力较全长相比下降约60%,细胞粘附能力较全长A类清道夫受体相比则下降约8.9%。结论A类清道夫受体的N端第1～27位氨基酸结构对于A类清道夫受体在细胞内的定位表达、结合和摄取配体以及调节细胞粘附的功能具有重要的作用。

DNMT3a通过提升基因内部甲基化介导紫杉醇诱导的LINE-1异常表达

药物诱导的长散在重复序列LINE-1异常激活可促进细胞基因组不稳定,而基因组不稳定是促进肿瘤发生发展和耐药表型形成的重要因素。因此,探索LINE-1异常激活的分子机制具有重要的理论和临床意义。DNA甲基化是调控基因表达的重要方式,已知DNA甲基转移酶家族成员DNMT3a不仅能通过促进基因启动子甲基化抑制基因表达,还可通过增强基因内部甲基化上调基因表达。本实验室前期研究发现,将乳腺癌细胞暴露于化疗药物可诱导LINE-1异常高表达,但LINE-1启动子甲基化水平并无显著改变。本研究进一步探讨了在化疗药物压力下DNMT3a是否可通过增强LINE-1基因内部甲基化水平促进LINE-1在乳腺癌细胞中的异常高表达。ChIP实验和甲基分析结果显示,用化疗药物紫杉醇(PTX)处理乳腺癌细胞,不仅可以诱导DNMT3a表达,而且可以促进DNMT3a与LINE-1基因内部区域的结合,提升其基因内部甲基化水平,进而上调LINE-1的表达水平。利用表达载体增加细胞内DNMT3a的表达水平,可显著上调LINE-1基因内部的甲基化及基因的表达水平,而下调DNMT3a的表达可有效抑制LINE-1表达。上述研究结果表明,DNMT3a介导的基因非启动子区甲基化在药物诱导的LINE-1异常激活中发挥重要作用,为认识LINE-1在乳腺癌化疗耐药性形成过程中异常激活的机制提供了新思路。

无选择标记基因的优质香稻新品系培育

香味是稻米食味品质的主要性状之一,为培育无抗性选择标记基因的优质香稻新品系,以携带有超双元载体OSBADH2-RNAi的农杆菌菌株EHA105介导,将OSBADH2基因的RNA干扰结构和潮霉素抗性选择标记(HPT)基因同时导入优质粳稻武育粳3号成熟胚来源的愈伤组织中,经过在含有潮霉素的培养基上筛选和分化,获得了54个独立转化子,其中36个转化子同时含目的基因和HPT基因,共转化频率为66.7%;从这些转化子的后代中共筛选获得25个去除HPT基因的转化子,去标记频率为69.4%;通过KOH法等4种方法进行香味的鉴定,获得15个具有香味的株系。实时定量PCR分析结果表明,具香味株系中的OSBADH2基因的表达受到了明显抑制,进一步证明了香味的产生是由于OSBADH2基因被干扰而引起。农艺性状调查表明,抑制OSBADH2基因的表达对水稻产量相关性状,包括株高、千粒质量、穗粒数和结实率影响不明显。

CDP参与凋亡过程中远程调控元件mbr对于凋亡相关基因的转录调控作用

目的研究凋亡过程中SATB1降解后,CDP能否代替SATB1参与BCL2和NOXA的转录。方法在Jurkat细胞中过表达CDP,Real-time PCR检测BCL2和NOXA的转录。EMSA检测mbr元件和NOXA-SBS1上蛋白复合物的变化。结果在Jurkat细胞中,mbr元件和NOXA-SBS1上均存在SATB1蛋白,当SATB1和CDP比例改变后,mbr元件上SATB1蛋白复合物消失,取而代之的是CDP蛋白复合物。CDP可以促进NOXA的转录,抑制BCL2的转录。结论 SATB1与其同源异型蛋白CDP的比例变化可直接改变mbr增强子上蛋白复合物的组成。

氟化聚乙烯亚胺衍生物构成的胶束载体的构建、表征及其在跨血-脑屏障递送中的作用研究

目的:探讨由氟化聚乙烯亚胺(polyethyleneimine,PEI)衍生物构成的纳米胶束的构建、表征及其在跨血-脑屏障(blood-brain barrier,BBB)进行基因递送中的作用。方法:使用PEI和七氟丁酸酐(heptafluorobutyric anhydride,HFAA)通过化学反应合成PEI-HFAA,随后通过酰胺反应连接芥子酸(sinapic acid,SA)得到产物PEI-HFAA-SA(简称SPF),最终在SPF外包裹聚山梨酯80(polysorbate 80,PS80)得到最终产物PEI-HFAA-SA@PS80(简称SPFT)。通过傅里叶变换红外吸收光谱、核磁共振氟谱和核磁共振氢谱等对SPFT的分子键和元素组成进行分析,并通过动态光散射实验、琼脂糖凝胶阻滞实验和扫描电镜观察对其水合直径、质粒吸附及保护能力、载体质粒复合体的稳定性和形貌进行进一步表征。探究SPFT在小鼠神经胶质瘤细胞Neuro 2a中的基因转染效率和细胞毒性,通过尾静脉注射携带绿色荧光蛋白表达质粒的SPFT至C57BL/6J小鼠中,观察其在脑组织中的分布情况以及BBB内细胞的基因转染效果。结果:以SA和HFAA修饰以及PS80包裹的方法合成了SFPT。检测结果显示,SPFT水动力粒径100~200 nm,并且对质粒有一定的携带和保护作用。SPFT携带质粒在体外表现出良好的转染能力和生物相容性。体内实验显示,尾静脉注射后的SPFT在小鼠大脑中有聚集现象,能够携带质粒穿越BBB并进行基因递送。结论:SPFT具有一定生物相容性和良好的穿越BBB及基因递送能力,为脑部疾病的治疗药物递送提供了新的思路。

分子标记辅助选择改良特青及其杂交稻米的蒸煮与食味品质刘巧泉

特青是我国育成的一个超高产籼稻常规品种,同时也可作为两系杂交稻的重要亲本,但其直链淀粉含量较高,蒸煮与食味品质较差。采用水稻蜡质基因内的一个分子标记(称为PCR-AccⅠ)进行辅助选择育种,经回交转育向特青品种导入来自中等直链淀粉含量优质籼稻的Wx基因,选育了仍保持原有亲本主要农艺性状的3个优质品系特青TT-1、特青TT-2和特青TT-3。改良品系胚乳中Wx基因表达量较改良前明显下降,直链淀粉合成大幅减少,由改良前的28.5%成功下调至15%左右的中等偏低水平。用改良品系与培矮64S所配两系杂交组合仍能保持较高的结实率及其他优异农艺性状,而杂交稻米的直链淀粉含量明显改善。直链淀粉含量降低后对亲本及杂种稻米中胶稠度等其他蒸煮食味品质的改善也有明显作用。

农杆菌介导的水稻双载体共转化法中部分影响因素的研究

以T-DNA区分别只含有潮霉素选择标记基因(HPT)和GUS报告基因的双元载体pCAMBIA1300和pCAMBIA0301用于农杆菌介导的水稻共转化试验。根据经农杆菌浸染并共培养3d后水稻愈伤组织中的GUS瞬间表达情况及其稳定共转化率,测定了不同农杆菌菌株搭配及其不同浓度配比对共转化效率的影响。结果表明,在两种农杆菌菌液浓度比为1:1的情况下,农杆菌EHA105/pCAMBIA1300与EHA105/pCAMBIA0301组合共转化水稻的效率要高于其他菌株的组合;在以农杆菌EHA105/pCAMBIA1300与EHA105/pCAMBIA0301进行共转化时,两种菌液浓度比为1:2时共转化效率最高。