重组酶介导的日本血吸虫特异性基因片段核酸等温扩增检测方法的建立

目的建立一种可用于日本血吸虫特异性基因片段检测的重组酶介导的核酸等温扩增方法(RAA)。方法以日本血吸虫SjG28基因片段作为靶序列,根据RAA反应原理设计合成引物,建立并优化RAA反应体系。应用此方法与聚合酶链式反应(PCR)同时扩增梯度稀释的含不同拷贝数的SjG28基因片段TA克隆质粒及不同浓度的基因组DNA,以评价其敏感性;应用此方法检测曼氏血吸虫、似蚓蛔线虫、十二指肠钩口线虫基因组DNA及健康人血基因组DNA,以评价其特异性。结果建立的RAA法可特异性扩增日本血吸虫中国大陆株成虫及虫卵基因组DNA,反应可在30 min内完成。以重组质粒为模板,RAA法最低可检出的质粒拷贝数为20个/μL;以基因组DNA为模板,RAA法最低可检测浓度为0.01 ng/μL。建立的RAA法以健康人全血基因组DNA及曼氏血吸虫成虫、似蚓蛔线虫、十二指肠钩口线虫基因组DNA为模板的扩增结果均为阴性。结论本研究建立了一种反应快捷、敏感性和特异性均较高的RAA方法,其具有应用于日本血吸虫病基因诊断的价值。

基于重组酶介导核酸等温扩增反应的曼氏血吸虫基因检测方法的建立

目的建立一种可用于曼氏血吸虫特异性基因片段检测的重组酶介导的核酸等温扩增方法(Recombinase-aided amplification,RAA)。方法以曼氏血吸虫121 bp高重复基因片段作为靶序列,根据RAA反应原理设计、合成引物及荧光探针,建立并优化荧光RAA法反应体系。分别以不同拷贝数的含121 bp基因片段的重组质粒及不同浓度曼氏血吸虫基因组DNA为模板进行荧光RAA法扩增,评价该方法的敏感性;分别以日本和埃及血吸虫虫卵、十二指肠钩虫虫卵、华支睾吸虫囊蚴基因组DNA为模板进行荧光RAA法检测,评价其特异性。结果建立的荧光RAA法可在39℃、20 min内特异性扩增曼氏血吸虫基因组DNA。以重组质粒为模板,荧光RAA法最低可检出的质粒拷贝数为10拷贝/μL;以基因组DNA为模板,荧光RAA法最低可检测浓度为0.1 fg/μL。以日本血吸虫虫卵、埃及血吸虫虫卵、十二指肠钩虫虫卵、华支睾吸虫囊蚴基因组DNA为模板进行荧光RAA法检测,结果均为阴性。结论成功建立了一种可用于曼氏血吸虫DN A检测的荧光RAA法,该方法反应快捷、操作简便,敏感性和特异性均较好。

结合重组酶介导的核酸等温扩增和荧光探针快速检测日本血吸虫基因片段

目的结合重组酶介导的核酸等温扩增(recombinase aided amplification, RAA)和荧光探针方法建立日本血吸虫特异性基因片段的快速检测方法。方法以日本血吸虫G28 (Sj G28)基因片段作为靶序列,应用DNAMAN 7.0软件设计合成引物及荧光探针,建立荧光RAA反应体系。扩增不同拷贝数的Sj G28重组质粒,评价荧光RAA检测的敏感性;分别以日本血吸虫、曼氏血吸虫、细粒棘球绦虫、十二指肠钩口线虫、似蚓蛔线虫、华支睾吸虫基因组为模板进行荧光RAA检测,以评价该方法的特异性。采用荧光RAA分别检测500、 200和50条日本血吸虫尾蚴感染的兔粪中虫卵DNA。分别在50只阴性钉螺中混入1、 2、 3、 4、 5、 10只阳性钉螺,并提取DNA进行荧光RAA检测。结果以不同拷贝数的Sj G28重组质粒为模板进行荧光RAA扩增,在5 min时即可观察到明显的荧光信号,随着拷贝数的不断降低,检测到荧光信号的时间也随之延长,不同拷贝数的扩增均在10 min内完成,最低可检出的质粒浓度为10拷贝/μl。以曼氏血吸虫、细粒棘球绦虫、十二指肠钩口线虫、似蚓蛔线虫及华支睾吸虫基因组DNA为模板的荧光RAA扩增结果均为阴性。不同数量尾蚴感染的兔粪中提取的DNA样品经荧光RAA检测,均能得到有效的扩增,检测可在15 min内完成。含不同数量阳性钉螺的50只阴性钉螺提取的日本血吸虫DNA经荧光RAA检测,均能得到有效的扩增,检测可在10 min内完成。结论本研究建立的可检测日本血吸虫核酸片段的荧光RAA方法,反应快捷,敏感性和特异性均较高。

重组酶介导的斯氏并殖吸虫等温扩增荧光检测方法的建立及检测效果初步评价

目的建立一种基于重组酶介导的等温扩增(recombinase-aided isothermal amplification, RAA)技术的斯氏并殖吸虫快速核酸检测方法,并对其检测效果进行初步评价。方法从溪蟹样本中分离出斯氏并殖吸虫、卫氏并殖吸虫和三平正并殖吸虫囊蚴,提取基因组DNA进行分子鉴定。以斯氏并殖吸虫线粒体细胞色素c氧化酶亚基I基因(cytochrome coxidase 1, cox1)基因序列作为靶序列设计、制备、筛选引物及探针。以河南省济源市和洛阳市宜阳县斯氏并殖吸虫囊蚴基因组DNA为模板进行荧光RAA检测方法验证。以含斯氏并殖吸虫cox1基因序列的不同浓度重组质粒和斯氏并殖吸虫囊蚴基因组DNA为模板进行荧光RAA扩增,评价其检测灵敏度;应用建立的荧光RAA法同时检测卫氏并殖吸虫、三平正并殖吸虫、华支睾吸虫和日本血吸虫基因组DNA,评价其检测特异性。结果从溪蟹样本中分离出斯氏并殖吸虫、卫氏并殖吸虫和三平正并殖吸虫囊蚴,经分子鉴定和系统进化分析确认其与Gen Bank中并殖吸虫标准株基因序列具有同源性。成功建立了斯氏并殖吸虫荧光RAA检测方法,可在5 min内扩增到河南省济源市和洛阳市宜阳县采集的斯氏并殖吸虫囊蚴基因组DNA,而阴性对照无扩增。以重组质粒为模板,荧光RAA法最低检出限为10拷贝/μL重组质粒,且均在5 min内出现阳性扩增;以基因组DNA为模板,可检测到的最低模板DNA浓度为10 pg/μL,且均在10~15 min内出现阳性扩增。荧光RAA法检测卫氏并殖吸虫、三平正并殖吸虫、日本血吸虫和华支睾吸虫基因组DNA结果均为阴性。结论成功建立了一种基于荧光RAA技术的快速、敏感、特异的斯氏并殖吸虫核酸检测方法,在斯氏并殖吸虫病流行区溪蟹现场快速检测与虫种鉴定中具有潜在应用价值。

重组酶介导的核酸等温扩增荧光法快速检测日本血吸虫感染性钉螺

目的建立重组酶介导的核酸等温扩增荧光(Recombinase aided amplification,RAA)法快速检测日本血吸虫感染性钉螺技术,并探索钉螺样品的最佳处理方式。方法将钉螺样本分成3组,每组均含7个亚组,其中6个亚组分别为50只阴性钉螺中混合1、2、3、4、5、10只日本血吸虫感染性钉螺,1个亚组为100只阴性钉螺中混合1只感染性钉螺。3组钉螺分别采用压碎去壳核酸试剂盒提取法、压碎去壳核酸粗提法和直接压碎带壳核酸粗提法进行处理,并分别进行荧光RAA与PCR法检测,对检测结果进行比较。结果建立了荧光RAA检测技术,工作温度为39℃,30 min内即可完成日本血吸虫感染性钉螺检测。钉螺群体样本采用压碎去壳核酸试剂盒提取法处理后,荧光RAA法最低可检测到100只阴性钉螺中混合1只感染性钉螺,PCR法最低可检测到50只阴性钉螺中混合1只感染性钉螺;采用压碎去壳核酸粗提法处理后,荧光RAA法最低可检测到100只阴性钉螺中混合1只感染性钉螺,PCR法最低可检测到50只阴性钉螺中混合3只感染性钉螺;采用直接压碎带壳核酸粗提法处理后,荧光RAA法最低可检出50只阴性钉螺中混合10只感染性钉螺,PCR法仅可检测出50只阴性钉螺中混合10只感染性钉螺。结论成功建立了钉螺群体样本中日本血吸虫感染性钉螺快速检测的荧光RAA法,该方法具有快速、灵敏、操作简便等特点;压碎去壳核酸粗提法为钉螺样品的最优处理方式。

基于重组酶介导等温扩增技术的细粒棘球绦虫核酸检测方法的建立

目的建立一种基于重组酶介导等温扩增技术(RAA)的细粒棘球绦虫核酸检测方法。方法针对细粒棘球绦虫12S rRNA基因序列片段,设计、筛选并合成RAA特异性扩增引物和荧光检测探针,构建细粒棘球绦虫荧光RAA检测方法。分别以含靶序列的不同拷贝数重组质粒和不同浓度细粒棘球绦虫基因组DNA为模板进行荧光RAA扩增,评价其检测灵敏度;分别以细粒棘球绦虫、多房棘球绦虫、日本血吸虫、曼氏血吸虫、十二指肠钩虫、华支睾吸虫、牛带绦虫、曼氏迭宫绦虫、猪带绦虫基因组DNA为模板进行荧光RAA扩增,评价其检测特异性。结果成功建立了细粒棘球绦虫荧光RAA检测法,在39℃条件下20 min内可以实现对细粒棘球绦虫基因组DNA特异性扩增,最低可以检测出10拷贝/μL含靶序列的重组质粒DN A和0.1 ng/μL细粒棘球绦虫基因组DN A样本,具备较高敏感性;对多房棘球绦虫、日本血吸虫、曼氏血吸虫、十二指肠钩虫、华支睾吸虫、牛带绦虫、曼氏迭宫绦虫、猪带绦虫基因组DNA均无阳性扩增,具备较高特异性;且该荧光RAA法可成功检出细粒棘球绦虫包囊中DNA。结论成功建立了一种快速、灵敏、特异的可用于细粒棘球绦虫核酸检测的荧光RAA法。

重组酶介导的华支睾吸虫特异性核酸等温扩增方法的建立及初步评价

目的建立一种可用于华支睾吸虫检测的重组酶介导的等温核酸扩增方法(RAA)。方法以华支睾吸虫18S rRNA基因序列作为靶序列,设计、合成、筛选特异性引物和探针,建立快速检测华支睾吸虫的荧光RAA检测方法。分别以含不同拷贝数DNA片段的重组质粒和不同浓度华支睾吸虫基因组DNA为模板进行荧光RAA扩增,评价其检测敏感性;分别以似蚓蛔线虫、细粒棘球绦虫、日本血吸虫、十二指肠钩虫、曼氏血吸虫基因组DNA为模板进行荧光RAA扩增,评价其检测特异性;通过抽提含华支睾吸虫虫卵的粪便及含囊蚴的淡水鱼肉样本DNA并进行荧光RAA扩增,初步评价其检测现场样本的能力。结果成功建立了华支睾吸虫检测荧光RAA法,其可在39℃20 min内实现对华支睾吸虫DNA的特异性扩增。以含不同拷贝数DNA片段的重组质粒为模板,该方法最低检出限为10拷贝/μL;以不同浓度华支睾吸虫基因组DNA为模板,该方法最低检出限为3 pg/μL;以似蚓蛔线虫、细粒棘球绦虫、日本血吸虫、十二指肠钩蚴及曼氏血吸虫基因组DNA为模板,检测结果均为阴性。该方法可成功检出感染华支睾吸虫的人体、大鼠粪便样本以及麦穗鱼样本,具备较好的现场样本检测能力。结论成功建立了一种简便、快速、敏感、特异的可用于华支睾吸虫检测的RAA法。

基于重组酶介导等温扩增技术的广州管圆线虫核酸检测方法的建立

目的建立一种基于重组酶介导等温扩增技术(RAA)的广州管圆线虫核酸检测方法。方法选择广州管圆线虫内转录间隔区1(ITS1)基因序列作为靶基因序列,设计、合成并筛选出特异性最强的引物和探针,构建用于广州管圆线虫核酸检测的基础及荧光RAA检测方法。分别以含检测靶基因片段序列的不同拷贝数重组质粒以及不同浓度广州管圆线虫基因组DNA为模板进行焚光RAA扩增,评价其检测敏感性;分别以广州管圆线虫、曼氏血吸虫、似蚓蛔线虫、华支睾吸虫、细粒棘球绦虫、十二指肠钩口线虫及小管福寿螺和藁杆双脐螺螺体基因组DNA为模板进行荧光RAA扩增,评价其检测特异性。结果成功建立了用于广州管圆线虫核酸检测的荧光RAA法,该方法可在37℃20min内对广州管圆线虫特异性DNA片段实现实时扩增。以含靶基因片段序列的不同拷贝数重组质粒和不同浓度广州管圆线虫基因组DNA为模板时,该法最低检出限分别为10拷贝/μL重组质粒和100 pg/μL基因组DNA;以曼氏血吸虫、似蚓蛔线虫、华支睾吸虫、细粒棘球绦虫、十二指肠钩口线虫及小管福寿螺和藁杆双脐螺螺体基因组DNA为模板,检测结果均为阴性。结论成功建立了一种可用于广州管圆线虫核酸检测的荧光RAA法,其检测简便快速,具备较好的敏感性和特异性。

基于重组酶介导核酸等温扩增技术的日本血吸虫特异性基因片段核酸试纸条检测方法的建立

目的结合重组酶介导核酸等温扩增技术(recombinase-aided isothermal amplification assay,RAA)和核酸试纸条建立一种快速检测日本血吸虫特异性基因片段的方法。方法以日本血吸虫SjG28基因片段作为靶序列,设计并合成引物、荧光探针,建立日本血吸虫核酸试纸条检测方法。通过检测不同拷贝数的含SjG28基因片段的重组质粒和不同浓度的日本血吸虫成虫基因组DNA,对该方法敏感性进行评价;通过检测华支睾吸虫、曼氏血吸虫、十二指肠钩口线虫、埃及血吸虫、巴贝斯虫和卫氏并殖吸虫基因组DNA,对该方法特异性进行评价。结果以重组质粒为模板,建立的日本血吸虫特异性基因片段核酸试纸条检测方法最低检测限为10拷贝/μL;以成虫基因组DNA为模板,最低检测限为1 pg/μL。该方法检测华支睾吸虫、曼氏血吸虫、十二指肠钩口线虫、埃及血吸虫、巴贝斯虫和卫氏并殖吸虫基因组DNA结果均为阴性。结论本研究结合RAA技术和核酸试纸条建立了一种可快速、简便、可视化检测日本血吸虫特异性基因片段的核酸试纸条法。

重组酶介导的隐孢子虫属特异性等温核酸扩增方法的建立及评价

目的建立一种可用于隐孢子虫检测的重组酶介导的等温核酸扩增(RAA)方法,并对其检测敏感性和特异性进行评价。方法以隐孢子虫属特异性18S rRNA核酸序列作为检测靶标,采用Amplfix软件设计、合成引物及荧光检测探针,构建并优化RAA荧光反应体系;分别以不同拷贝数的含18S rRNA靶序列的重组质粒、不同浓度隐孢子虫卵囊基因组DNA及不同数量隐孢子虫卵囊基因组DNA为模板进行RAA荧光法检测,以评价其敏感性;分别以隐孢子虫卵囊、蓝氏贾第鞭毛虫包囊、日本血吸虫虫卵、似蚓蛔线虫虫卵、华支睾吸虫虫卵、沙门氏菌、志贺氏菌基因组DNA为模板进行RAA荧光法检测,以评价其特异性。结果成功建立了隐孢子虫检测RAA法,该方法可在39℃、20 min内得到隐孢子虫属18S rRNA基因片段的有效扩增。以不同拷贝数的含18S rRNA靶序列的重组质粒、不同浓度隐孢子虫卵囊基因组DNA及不同数量隐孢子虫卵囊基因组DNA为模板,该方法最低检出限分别为102拷贝/μL、1 pg/μL和1个/50μL;以蓝氏贾第鞭毛虫包囊、日本血吸虫虫卵、似蚓蛔线虫虫卵、华支睾吸虫虫卵、沙门氏菌、志贺氏菌基因组DNA为模板的荧光RAA扩增结果均为阴性。结论成功建立了一种可用于检测隐孢子虫卵囊DNA的RAA法,该方法操作简便、反应快速,敏感性和特异性均较好。

重组酶介导的蓝氏贾第鞭毛虫特异性等温核酸扩增方法的建立及评价

目的建立基于重组酶介导的等温扩增技术(RAA)的蓝氏贾第鞭毛虫核酸检测方法,并评价其检测敏感性和特异性。方法选择蓝氏贾第鞭毛虫β-贾第素(β-giardin)基因作为检测靶基因,设计、合成特异性检测引物及荧光探针,建立荧光RAA检测体系。分别以不同拷贝数的重组质粒(含β-giardin基因靶序列)和不同浓度蓝氏贾第鞭毛虫基因组DNA为模板进行荧光RAA扩增,评价其检测敏感性;分别以蓝氏贾第鞭毛虫、日本血吸虫、华支睾吸虫、微小隐孢子虫、似蚓蛔线虫、沙门氏菌及志贺氏菌基因组DNA为模板进行扩增,评价其检测特异性。结果成功建立了蓝氏贾第鞭毛虫荧光RAA检测方法,其可在等温(39℃)条件下实现对靶基因片段的快速、特异性扩增(20 min内)。分别以重组质粒和蓝氏贾第鞭毛虫基因组DNA为模板,该方法的检测敏感性可达10~2拷贝/μL和1 pg/μL;以日本血吸虫、华支睾吸虫、微小隐孢子虫、似蚓蛔线虫、沙门氏菌及志贺氏菌基因组DNA为模板的RAA检测结果均为阴性,具备较好特异性。结论建立了一种操作简便、敏感、特异的可用于蓝氏贾第鞭毛虫核酸检测的荧光RAA方法。

重组酶介导的核酸等温扩增荧光法检测日本血吸虫感染性钉螺的效能评价

目的评价重组酶介导的核酸等温扩增(recombinase-aided amplification,RAA)荧光法检测日本血吸虫感染性钉螺的效能。方法采用群体法检测。每50只钉螺作为1个检测样本,阴性样本不含感染性钉螺,阳性样本含不同数量感染性钉螺。设置阴性样本10个和分别含有1、2、3只感染性钉螺的阳性样本各10个,40个样本随机分组后,以盲法经荧光RAA法检测,并以逸蚴法检测结果为金标准,计算荧光RAA法检测灵敏度、特异度、正确指数及符合率。设置阴性钉螺样本5个和分别含有1、2、3只感染性钉螺的阳性样本各5个,20个样本随机分组后,采用配对设计法对同一个样本以盲法分别经压碎镜检法和荧光RAA法进行检测并比较检测结果。结果荧光RAA法检测30个阳性样本,29个检测结果为阳性,灵敏度为96.67%;检测10个阴性样本,其中8个检测结果为阴性,特异度为80.00%;约登指数为0.77,同一样本重复检测10次符合率为100%。荧光RAA法与压碎镜检法检测感染性钉螺结果差异无统计学意义(χ^(2)=0,P>0.05),检测结果与实际符合率分别为95.00%(19/20)和90.00%(18/20)。结论荧光RAA法对日本血吸虫感染性钉螺具有良好检测效能,在日本血吸虫感染性钉螺筛查中具有一定应用前景。