胰腺癌循环微小核糖核酸载体的研究

目的 寻找胰腺癌循环微小核糖核酸（miRNA）的载体.方法 常规培养、传代胰腺癌细胞SW1990、BxPC3,采集6例胰腺癌患者及6例健康体检者（对照组）的血清.应用梯度离心方法获取血清和细胞培养上清中的微囊泡（MV）.采用蛋白质印迹法检测RNA诱导沉默复合体的核心元件Ago2蛋白和MV的标志性蛋白CD63,采用荧光定量PCR方法检测MV包裹的和游离的miRNA.结果 胰腺癌细胞株培养上清的MV中含有Ago2、CD63蛋白.胰腺癌组、对照组的血清及MV中均存在miR-20a、miR-21、miR-24、miR-25、miR-191、miR-483-5p,但以MV包裹的量较多,且胰腺癌组MV包裹的miRNA量与对照组不完全一致,其中miR-20a、miR-24、miR-191分别为对照组的（2.93±0.29）、（2.73±0.46）、（2.39±0.51）倍,差异均有统计学意义（F值分别为75.97、25.80、12.94,P＜0.05或＜0.01）.结论 MV是胰腺癌循环miRNA的主要载体.

胰腺癌细胞与其基质成纤维细胞相互影响的研究

目的观察胰腺癌细胞系BXPC-3、SW1990能否促进其基质中正常成纤维细胞(NFs)活化成癌相关成纤维细胞(CAFs)及其活化的可能机制,以及活化后的CAFs对BXPC-3、SW1990细胞迁移能力的影响。方法采用差异贴壁法分选出野生型小鼠C57胰腺组织中的NFs,后运用非接触式共培养方法将BXPC-3、SW1990与NFs共培养,共培养后采用免疫荧光方法检测共培养前后NFs中CAFs标志性蛋白α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)、成纤维细胞活化蛋白(FAP)的表达变化,以确定其是否活化,并且运用qRT-PCR法检测目前较公认的胰腺癌中升高的12种miRNAs在共培养前后的NFs中含量变化;采用transwell法观察活化前后的NFs对BXPC-3、SW1990迁移能力的影响。结果免疫荧光检测表明,与BXPC-3、SW1990共培养后,NFs中α-SMA、FAP表达均显著升高;同时,在所选取的12种miRNAs中,与BXPC-3、SW1990共培养后,NFs中miR-155含量均有明显升高。BXPC-3、SW1990在CAFs基质环境中迁移能力大大提高。结论胰腺癌细胞能够促进其周围NFs活化成CAFs,其活化可能与胰腺癌中某些特定的miRNA分泌进入到NFs中有关,活化后的CAFs又可以反过来促进胰腺癌细胞的迁移。

微小核糖核酸-148a调控胰腺癌细胞中ErbB3的表达

目的 在胰腺癌细胞中寻找并验证微小核糖核酸（miRNA）-148a的下游调控基因.方法 运用生物信息学方法预测miRNA-148a调控的目的基因,构建含目的基因的3’端非翻译区（3＇-UTR）的荧光素酶报告质粒,用脂质体转染miRNA-148a类似物和抑制剂进入胰腺癌细胞BXPC-3,检测荧光素酶活性,确定miRNA-148a是否直接与靶基因3’-UTR结合.同时改变胰腺癌细胞BXPC-3中miRNA-148a表达水平,用Western免疫印迹法在蛋白水平检测靶基因ErbB3表达的变化.统计学处理采用单因素方差分析.结果 生物信息学发现ErbB3和miRNA-148a上有一个保守的结合靶位点.miRNA-148a直接与ErbB3的3’-UTR结合,使荧光素酶活性下降到阴性对照的[-（25.00±4.70）％,F=4.66,P＜O.01]；过表达miRNA-148a后,BXPC-3细胞中ErbB3蛋白水平灰度值下降到阴性对照的[（26.16±4.69）％,F=6.563,P＜O.05].结论 miRNA-148a在胰腺癌细胞株BXPC-3中直接靶向并调控ErbB3的表达.

2型糖尿病及其微血管并发症患者血清miR-342-5p和miR-423-5p水平测定及临床意义

目的检测2型糖尿病（T2DM）及其微血管并发症患者血清miR-342-5p、miR-423-5p及氧化脂蛋白水平,分析其潜在的临床意义。方法用实时荧光定量PCR检测50例T2DM、T2DM微血管并发症患者及体检健康者血清miR-342-5p和miR-423-5p表达水平;ELISA法检测其ox-LDL,ox-Lp（a）,β2-GPⅠ-ox-LDL,β2-GPⅠ-Lp（a）的含量;生化分析仪测定相关生化指标。结果与健康对照组血清miR-342-5p和miR-423-5p表达水平[分别为0.144（0.027,0.487）fmol/L;1.480（0.676,2.580）fmol/L]比较,T2DM患者[0.234（0.103,1.241）fmol/L（U=779,P〈0.01）;3.398（1.742,7.351）fmol/L（U=606,P〈0.01）]和T2DM微血管并发症患者[0.300（0.102,2.760）fmol/L（U=731,P〈0.01）;3.886（2.021,9.430）fmol/L（U=488,P〈0.01）]表达水平显著上升。miR-342-5p和miR-423-5p对T2DM患者诊断的ROC曲线下面积（AUCROC）分别为0.688（95%CI：0.586~0.791）和0.758（95%CI：0.664~0.851）,对T2DM微血管并发症患者分别为0.702（95%CI：0.600~0.803）和0.801（95%CI：0.716~0.886）;T2DM和T2DM微血管并发症患者ox-LDL、ox-Lp（a）、β2-GPⅠ-ox-LDL、β2-GPⅠ-Lp（a）水平亦显著高于健康对照组（P均〈0.05）。Spearman秩相关分析显示,miR-342-5p和miR-423-5p与FPG、ox-LDL、ox-Lp（a）、β2-GPⅠ-ox-LDL、β2-GPⅠ-Lp（a）呈显著正相关（P均〈0.05）。结论 miR-342-5p和miR-423-5p可能作为T2DM及其微血管并发症的辅助诊断指标。