甲型流感病毒实验室微环境监测研究

目的分析甲型流感病毒实验室微环境中的污染状况,为在微生物实验室内开展相关实验活动提供生物安全指导。方法对5所甲型流感病毒实验室内的关键设施设备及仪器进行细化采样;提取样本的核酸,用实时荧光定量PCR(RT-PCR)法检测甲型流感病毒的核酸;犬肾细胞(MDCK)培养方法检测核酸阳性样本中甲型流感病毒的活性。结果在1所甲型流感病毒实验检出甲型流感病毒核酸阳性率为3.50%(5/143),阳性位点为生物安全柜的台面操作区、生物安全柜挡风玻璃把手及冰箱内部,各核酸阳性率分别为6.25%(2/32),8.33%(1/12)及33.33%(2/6);将核酸阳性样本接种MDCK细胞的培养结果显示,核酸阳性样本均无感染活性。结论在实验室微环境的重点部位存在较高的病原体污染风险(如冰箱内部),提示实验人员应进一步增强生物安全意识,并在实验操作结束后用消毒剂彻底进行清场消毒工作。

BG-Trap法与双层叠帐法对登革热媒介白纹伊蚊监测效果的比较

目的比较BG-trap法与双层叠帐法对登革热媒介白纹伊蚊的监测效果,进一步探讨BG-trap法用于登革热媒介伊蚊监测的可能性,为制定更有效的登革热防控策略提供参考依据。方法实验选取江苏省3个设区市的6个户外监测点,于8—9月的3天时间中,分别于每日16:00-16:30、17:00-17:30、18:00-18:30三个时段同步开展BG-Trap法和双层叠帐法监测。结果BG-Trap法和双层叠帐法均能够有效地捕获白纹伊蚊的雌蚊,双层叠账法捕获的白纹伊蚊占比高于BG-Trap法(χ^(2)=16.034,P<0.01),两种方法捕获的白纹伊蚊雌蚊构成比之间差异无统计学意义(χ^(2)=0.162,P=0.687)。BG-Trap法捕获的白纹伊蚊平均密度指数为7.85±5.23只/(台·h),低于双层叠帐法的27.04±13.86只/(顶·h),差异有统计学意义(t=6.73,P<0.001)。结论BG-Trap法对登革热媒介白纹伊蚊监测效果不及双层叠帐法,其能否应用于登革热媒介伊蚊监测有待于进一步研究。

2017-2021年江苏省临床分离耶尔森菌分子特征分析

目的:了解江苏省腹泻患者临床分离耶尔森菌的分布特点及分子特征。方法:2017-2021年,在小肠结肠炎耶尔森菌国家级主动监测点江苏省徐州市铜山区和盐城市东台市,采集腹泻患者粪便标本,进行耶尔森菌菌株分离;同时,收集全省哨点医院疑似耶尔森菌菌株。提取分离菌株DNA进行全基因组重测序,并上传至EnteroBase数据库进行耶尔森菌种型鉴定,原始数据经清洁和处理后进行16S核糖体RNA(16S rRNA)基因多态性分析;通过美国国家生物技术信息中心(NCBI)和病原菌毒力因子数据库(VFDB)扫描5种毒力基因(ail、ystA、ystB、yadA、virF)携带情况,同时构建K-mer树并进行基因组特征分析。结果:2017-2021年,共采集腹泻患者粪便标本2 058份,经分离鉴定,得到57株耶尔森菌;同时,通过哨点医院收集到2株耶尔森菌。经EnteroBase数据库比对,51株菌为小肠结肠炎耶尔森菌,4株菌为 Yersinia proxima,阿利克西奇耶尔森菌、马赛耶尔森菌、中间耶尔森菌及 Yersinia canariae各1株。16S rRNA基因多态性分析显示,全部菌株被聚类为3个大组,可区分小肠结肠炎耶尔森菌和其他耶尔森菌。51株小肠结肠炎耶尔森菌中,49株为毒力基因Ⅲ型(ail-、ystA-、ystB+、yadA-、virF-),2株为毒力基因Ⅱ型(ail+、ystA+、ystB-、yadA-、 virF-);8株其他耶尔森菌均为毒力基因Ⅳ型(ail-、ystA-、ystB-、yadA-、virF-)。K-mer分析可区分小肠结肠炎耶尔森菌和其他耶尔森菌,JS-XZ-2020001菌株与其他小肠结肠炎耶尔森菌距离较远,血清型为O8的小肠结肠炎耶尔森菌分布较集中。 结论:江苏省腹泻患者临床分离耶尔森菌以小肠结肠炎耶尔森菌为主,其他耶尔森菌少量并存,同时发现了 Yersinia proxima和 Yersinia canariae两个耶尔森菌新种型。小肠结肠炎耶尔森菌的毒力基因携带以Ⅲ型为主。16S rRNA基因多态性分析和K-mer分析均可有效区分小肠结肠炎耶尔森菌和其他耶尔森菌。

江苏省新型冠状病毒NSP1变异分析及其与临床分型的关系

目的探讨江苏省新型冠状病毒(severe acute respiratory syndrome coronavirus 2,SARS-CoV-2)非结构蛋白1(nonstructural protein 1,NSPl)变异情况及其与临床分型的关系。方法收集2020—2022年间江苏省SARS-CoV-2感染病例的样本及基本临床信息。对样本进行高通量测序,测序后的数据以Wuhan-Hu-1(GenBank:MN908947.3)为参考基因分析NSP1序列变异情况及其与临床分型的关系。使用DynaMut在线服务器分析突变氨基酸对蛋白质稳定性及分子柔韧性的影响。结果共收集病例样本1241例,NSP1基因同义突变61例,错义突变及缺失共487例,存在氨基酸变异的患者以无症状感染者(75.4%)为主,且病例临床分型严重程度更轻(Z=-24.8,P<0.01)。共发现NSP1蛋白出现11个非同义突变和1个缺失。N端中出现了8个稳定突变及1个失稳突变,2个突变增加了分子柔韧性;Linker区S135R的突变使蛋白质失稳但增加了柔韧性;C端R171C突变使蛋白质稳定但降低了柔韧性。NSP1蛋白稳定性降低的患者临床分型症状更轻。结论NSP1部分氨基酸的改变使蛋白结构发生变化,可能降低病毒的致病力,导致较轻的临床症状。

溴氰菊酯长效驱蚊帐灭蚊效果观察

为观察0.3%溴氰菊酯长效驱蚊帐对蚊虫的杀灭效果,参照NY/T 1151.4—2012标准进行实验室和模拟现场药效测试。结果显示,0.3%溴氰菊酯长效驱蚊帐在接触试验中,洗涤前、洗涤10次与洗涤20次后,对淡色库蚊1 h平均击倒率分别为100%、96.49%、93.94%;在模拟现场试验中,0.3%溴氰菊酯长效驱蚊帐洗涤20次后,对淡色库蚊12 h平均击倒率为93.68%,24 h平均死亡率为93.68%。试验表明,0.3%溴氰菊酯长效驱蚊帐具有持久、有效的防蚊灭蚊效果。

基于线粒体ND5基因的我国三省三带喙库蚊种群分化研究

三带喙库蚊是乙型脑炎病毒等多种虫媒病毒的重要传播媒介,我国江苏、浙江和海南省普遍种植水稻,为三带喙库蚊孳生的适宜环境。为了调查三带喙库蚊在这三省的种群分化状态,本研究拟以线粒体ND5基因作为遗传标记对各区域三带喙库蚊种群的遗传多样性和结构进行探讨。结果显示,各区域三带喙库蚊的遗传多样性较高,单倍型多样性指数(Hd)为0.533~0.981,且浙江省三带喙库蚊单倍型多样性指数(0.944)要略高于海南省(0.931)和江苏省(0.910)。各三带喙库蚊种群以单倍型H1、H2和H3为主,而单倍型H9和H12仅分布于海南海口(HNHK)、单倍型H15和H18仅分布于浙江金华(ZJJH)、单倍型H20、H21和H22仅分布于江苏连云港(JSLG)以及单倍型H24和H25仅分布于江苏盐城。UPGMA聚类结果表明该区域三带喙库蚊种群共演化出两个聚类分支,且海南海口株(HNHK)与江苏连云港株(JSLG)、江苏淮安株(JSHA)以及江苏盐城株(JSSY)之间的基因流较强,分别达到13.927、17.423和10.976;江苏连云港株(JSLG)与浙江台州株(ZJTZ)之的基因流达到11.222。AMOVA分析结果显示该区域三带喙库蚊种群分化的主要分子变异来于区域内的各种群之间,所占变异百分比为95.93%;同时,中性检测结果表明三带喙库蚊种群未出现明显的种群扩张。

公共电梯金黄色葡萄球菌的污染状况调查及消毒剂抗性研究

目的调查医院和宾馆公共电梯按钮金黄色葡萄球菌的污染状况,并观察金黄色葡萄球菌对常用消毒剂的抗性。方法采用Baird-Parker筛选培养基分离金黄色葡萄球菌,通过聚合酶链式反应对消毒剂抗性基因qacA/B、smr进行扩增,用最小抑菌浓度(MIC)和最小杀菌浓度(MBC)评价金黄色葡萄球菌对常用消毒剂的抗性。结果从83份公共电梯按钮样本中共检出金黄色葡萄球菌阳性样本21份,检出率为25.3%。医院和宾馆电梯按钮金黄色葡萄球菌的检出率分别为10.0%和39.5%,差异有统计学意义(P=0.002)。分离出的21株金黄色葡萄球菌均未检测出基因qacA/B、smr,但一些菌株对季铵盐消毒剂的抗力要高于标准菌株。结论宾馆电梯按钮金黄色葡萄球菌的污染状况比医院电梯按钮更加严重,发现部分金黄色葡萄球菌对季铵盐消毒剂产生了抗性。

纯净水中病毒三种富集方法的比较

目的比较膜吸附法、膜吸附-PEG法和膜吸附-超滤法对纯净水中病毒的富集效果,并对优选的富集方法的实验条件进行比对,旨在寻找高效的方法,为其他水体中病毒富集检测提供技术借鉴。方法本文以MS2噬菌体为目标病毒,制作高、低浓度水样,建立逆转录-荧光定量聚合酶链式反应(RT-qPCR)方法的标准曲线,进行定量检测。使用膜吸附法、膜吸附-PEG法和膜吸附-超滤法富集水样,并比较不同过滤膜、不同超滤管及两种核酸提取方法的回收率,选择最适方法。结果膜吸附-超滤法、膜吸附-PEG法和膜吸附法回收率均值分别为19.80%±12.19%、12.71%±9.09%和9.05%±4.89%,各因素对回收率的影响顺序为:膜吸附-超滤法>膜吸附-PEG法>膜吸附法;高浓度>低浓度。混合纤维素酯膜的富集效果优于尼龙膜。100 K和50 K的超滤管富集效果无差异。硅胶离心柱法和磁珠法核酸提取效果无差异。结论通过二次富集可提高富集效率,膜吸附-超滤法优于另两种方法,且其操作简单、耗时短、对设备依赖性低,易于推广。膜吸附-超滤法的实验条件仍可优化、完善,拓展其在不同水体和不同病毒富集中的应用。

新型冠状病毒非结构蛋白1重要变异对其与病毒5’UTR结合能力的影响

目的探讨新型冠状病毒(2019 novel coronavirus,2019-nCoV)非结构蛋白1(NSP1)重要变异对其与病毒5’UTR结合能力的影响,为抗病毒药物和疫苗的研发提供线索。方法对2019-nCoV基因组数据库进行生物信息分析,选取可能影响NSP1结构及与5’UTR的结合能力的氨基酸变异位点(T12A、R124L、N128I、K141A、GHVMV82-86DEL及KSF141-143DEL),PSIPRED在线工具分析变异体的二级结构,mCSM-NA预测其与RNA的结合能力,DynaMut webserver分析变异对蛋白稳定性的影响;构建变异体质粒,转染HEK-293T细胞,利用双荧光素酶报告基因实验和RNA结合蛋白免疫沉淀(RNA binding protein immunoprecipitation,RIP)实验检测NSP1变异体与病毒5’UTR的结合能力。结果生物信息分析预测除了R124L突变外,其他5种变异体均可改变蛋白二级结构,T12A、R124L、N128I和K141A突变均可以降低与RNA的结合能力,而T12A、R124L、N128I突变降低了蛋白质的稳定性,实验表明R124L、N128I、GHVMV82-86DEL及KSF141-143DEL显著减弱了NSP1与5’UTR的结合能力。结论部分NSP1氨基酸突变或缺失可改变其二级结构,并能够显著减弱NSP1与5’UTR的结合能力,提示可能改变病毒的致病能力,为抗病毒药物和疫苗的研发提供了理论依据。

纯净水中病毒富集和浓缩方法优化及筛选

目的使用膜吸附(混合纤维素酯膜,MCE)–超滤法对纯净水中的病毒进行富集浓缩,通过优化其富集试验条件,研究不同试验条件下纯净水中病毒的富集和浓缩效率,筛选最优试验条件。方法以噬菌体MS2为目标病毒,首先对膜吸附过程中4个影响因素进行多水平的排列组合试验,再使用筛选出的最优条件与超滤过程中2个影响因素进行组合筛选,使用实时荧光定量逆转录聚合酶链式反应(RT-qPCR)技术检测、计算噬菌体MS2的回收率,最后对试验数据进行统计学分析。结果MCE-超滤法的最优富集条件为:阳离子浓度(0.025 mol/L)、MCE膜的孔径(0.22μm)、洗脱液(1%TGBE)、洗脱方式(震荡洗脱)、超滤管截留分子量(30 kD)、离心力(3000 g)。优化后的MCE-超滤法对纯净水中的噬菌体MS2病毒回收率可达到81.20%(95%CI=71.86%~90.54%)。结论经优化后的MCE-超滤法对纯净水中的噬菌体MS2病毒有较高的回收率,可用于纯净水中病毒的富集浓缩。