双向凝胶电泳和质谱技术在男性生殖医学研究中的应用

人类基因组计划已基本完成,包括蛋白质组时代的后基因组时代已经到来,蛋白质组研究旨在揭示基因组表达的真正执行生命活动的全部蛋白质的表达规律和生物功能。借助于蛋白质组研究的两种基本技术手段——双向凝胶电泳和质谱技术,阐明与男性生殖功能密切相关的蛋白质及其功能,必将有助于深入理解睾丸发育/精子发生的生理机制,揭示男性不育的发病机理,最终对男性生殖健康产生深远的影响。

聚精丸治疗少精子症的实验研究

目的：观察聚精丸对少精子症患者精子超微结构和生精细胞凋亡的影响，探讨聚精丸对精子生成的作用机制。方法：50例少精子症患者口服聚精丸5g／次，3次／d，3个月为1个疗程，连续服用1—4个疗程，分别于治疗前、治疗1、3、6、12个月后，通过透射电镜和流式细胞仪（FCM）观察精子超微结构和生精细胞的凋亡、生精细胞倍体比例的变化。结果：①精子超微结构治疗6个月后顶体基质密度有所增加，治疗12个月后顶体膜形态完整性有明显改善；核的病理改变和尾部异常改变不明显。②生精细胞凋亡治疗后细胞碎片和凋亡细胞减少，治疗3个月后与治疗前比较差异有显著性（P〈0．05），治疗12个月后与治疗前比较差异有极显著性（P〈0．01）。⑧生精细胞倍体比例经聚精丸治疗3个月后，单倍体成熟精子增多，与治疗前比较差异有极显著性（P〈0．01）；脱落的精母细胞减少，与治疗前比较差异有显著性（P〈0．05）。结论：聚精丸可改善少精子症患者精子顶体基质密度和顶体膜结构形态的病理性改变，提高顶体膜和顶体酶的质量；降低生精细胞及精子凋亡速率，提高单倍体精子的百分率，降低二倍体细胞的百分率。

线粒体DNA与生殖

线粒体是细胞中能量储存和供给的场所，它含有一个独立的半自主复制的ＤＮＡ遗传系统，称为线粒体ＤＮＡ（ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌＤＮＡ，ｍｔＤＮＡ）。ｍｔＤＮＡ编码呼吸链的多种组成成分，进而参加氧化磷酸化（ｏｘｉｄａｔｉｖｅｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ...

类固醇生成因子在生殖功能中的作用

类固醇生成因子在生殖功能中的作用祝辉沙家豪周作民细胞色素Ｐ４５０类固醇羟化酶的表达具有组织特异性［１］。大量的研究已表明这些羟化酶至少共享一个调节因子——类固醇生成因子－１（ｓｔｅｒｏｉｄｏｇｅｎｉｃｆａｃｔｏｒ１，ＳＦ－１）。在许多种类的动物中，Ｓ...

人类辅助生殖技术来源胎盘全基因组表达谱研究

目的:通过比较辅助生殖技术(ART)来源和自然妊娠来源胎盘全基因组表达谱的差异,研究ART技术对胎盘功能和胎儿发育的影响,借此评估ART子代的安全性。方法:胎盘组织取自因输卵管因素行体外受精-胚胎移植和自然妊娠足月产妇各3例。利用AffymetrixHG-U133 Plus 2.0基因芯片对2组胎盘组织进行芯片杂交分析。用定量反转录聚合酶链反应(qRT-PCR)验证其中10个差异表达基因,根据其涉及的不同功能进行生物信息学分析。分为6类:免疫应答、跨膜转运、代谢、氧化应激、细胞分化及其他功能。用免疫组织化学对其中5个差异表达基因产物进行细胞定位研究。结果:ART来源胎盘组织中共鉴定出26个差异表达基因,其中17个上调,9个下调。其中涉及免疫应答的基因,如ERAP2和STAT4;涉及细胞分化的基因如MUC1,经qRT-PCR验证2组间确实存在差异表达。基因产物主要表达在胎盘绒毛组织中,分布在合体滋养层细胞的细胞质和(或)细胞膜中。结论:ART来源胎盘和自然妊娠胎盘存在全基因组表达谱差异。差异表达基因涉及到多种胎盘关键功能,ERAP2,STAT4及MUC1等差异表达基因可能作为评估胎盘与ART子代安全性关联的分子标记物。

MPA和MPA+TU对雄性大鼠生精功能和生殖激素的影响

目的 :观察单独使用醋酸甲孕酮 (MPA)和联合应用MPA与十一酸睾酮 (TU)对雄性大鼠血清FSH、LH、T和生精功能的影响。 方法 :2 0只大鼠随机均分为 4组 :A组为对照组 (给予生理盐水 ) ,B组小剂量MPA组 (37.5mg/kg) ,C组大剂量MPA组 (75mg/kg) ,D组为MPA +TU(MPA 75mg/kg ,TU 2 5mg/kg) ,肌肉注射 ,每月 1次 ,共 3个月。测定各组大鼠给药前后血清FSH、LH、T水平及各组大鼠精子计数和形态。 结果 :与对照组相比 ,处理组大鼠生精功能均明显受到抑制 ;单用MPA组的FSH、LH水平均显著降低 ;MPA +TU组的FSH、LH、T水平均明显下降 ,睾丸明显萎缩 ;与单用MPA组相比 ,MPA +TU组精子计数下降更显著 ,但血清FSH和LH受抑制的程度差异无显著性。 结论 :单独使用MPA可以抑制雄性大鼠血清FSH、LH水平并阻抑其生精功能 ;MPA +TU比单用MPA抑制生精效应更强。MPA +TU抑制生精的机制不仅仅在于反馈抑制促性腺激素 。

4′-甲醚-黄芩素对绒癌耐药细胞株多药耐药性的逆转作用研究

为探讨马鞭草中4′-甲醚-黄芩素对人绒癌JAR/VP16耐药细胞株的多药耐药逆转作用及可能的逆转机制,采用四甲基偶氮唑盐比色、透射电镜观察、逆转录多聚酶链反应、流式细胞术、基因芯片以及实时定量PCR等方法,检测到4'-甲醚-黄芩素对化疗药物具有协同增效作用,显著逆转耐药细胞对鬼臼乙叉甙(VP16)、甲氨蝶呤(MTX)及更生霉素(KSM)的耐药性,该药物作用后,耐药细胞超微结构呈现凋亡样改变,细胞凋亡率增高并出现明显凋亡峰.此外,耐药细胞中MDR1、MRP1、MRP2、MRP6、AHR、COMT、FGF2等耐药相关基因以及Bcl-2、BFL1、NAIP、p63等凋亡抑制基因表达降低,而Apaf-1、ASC、ATM、Bad、Bak、Bax、BimL等凋亡促进基因表达升高.上述实验结果表明:4′-甲醚-黄芩素对绒毛膜癌耐药细胞具有显著的耐药逆转作用,这种逆转作用可能是通过降低耐药基因表达、促进细胞凋亡实现的.

hCG对成年小鼠睾丸Leydig细胞中睾酮生成酶的调节作用

目的 从分子水平探讨 h CG对成年小鼠睾丸 L eydig细胞中胆固醇侧链裂解酶 (P45 0 scc)、17α-羟化酶 (P45 0 c17)和 3β-羟甾脱氢酶 (3βHSD)的调节作用。 方法 体外培养成年小鼠睾丸 L eydig细胞 ,分别测定培养1、8h h CG刺激组及对照组细胞培养上清中睾酮含量 ,同时运用半定量 RT- PCR及核酸内切酶酶切方法测定两组细胞中 P45 0 scc、P45 0 c17及 I、VI两型总的 3βHSD的 m RNA水平 ,并测定了 I、VI两型 3βHSD m RNA的比值。 结果 1.培养 1、8h刺激组睾酮含量均明显高于对照组 (1h P<0 .0 1,8h P<0 .0 0 5 ) ;2 .培养 8h,刺激组 P45 0 scc和P45 0 c17m RNA水平明显高于对照组 (P<0 .0 5 ) ;而培养 1、8h刺激组 I、VI两型总的 3βHSD m RNA水平和对照组相比均无明显差异 (P>0 .0 5 ) ,但 VI型 3βHSD m RNA和 I型 3βHSD m RNA的比值逐渐增高。 结论 h CG能在转录水平刺激 P45 0 scc、P45 0 c17及 VI型 3βHSD的表达 ,促进睾酮生成。

双向凝胶电泳和质谱技术在睾丸蛋白表达研究中的应用

目的 :探讨双向凝胶电泳和质谱技术在睾丸蛋白表达研究中的应用。 方法 :用双向凝胶电泳分离成年雄性ICR小鼠睾丸总蛋白 ;从胶上切下 2个蛋白点 ,经胶内原位酶解后 ,用质谱仪测得其肽质量指纹谱 ;再通过数据库检索鉴定蛋白质。 结果 :从胶上切下的 2个蛋白点数据库检索结果是小鼠血清白蛋白和蛋白质二硫化物异构酶。 结论 :用双向凝胶电泳分离睾丸蛋白样品取得了很高的分辨率 ,质谱技术鉴定蛋白快速方便 。

类固醇生成因子-1对青春期小鼠睾丸中睾酮生成及精子发生的调节

目的 探讨类固醇生成因子 1(SF 1)对青春期小鼠睾丸内分泌功能及精子发生过程的调节作用 ,并推测其可能机制。 方法 用免疫组织化学方法定位SF 1在不同年龄小鼠睾丸中的细胞分布 ,进一步分离有SF 1阳性表达信号的青春期小鼠Leydig细胞在体外进行培养 ,用反义转染方法抑制细胞内SF 1蛋白质的表达 ,检测细胞的睾酮分泌量及睾酮生成酶P4 5 0scc的mRNA水平变化。 结果 1 SF 1在青春期Leydig细胞核有表达 ;反义抑制细胞内SF 1蛋白质的表达 ,则细胞的睾酮分泌量及P4 5 0sccmRNA水平均显著下降 ;2 SF 1在青春期小鼠睾丸B型精原细胞及细线期、偶线期、粗线期的初级精母细胞核中也有表达。 结论 1 SF 1参与调节青春期睾丸Leydig细胞中P4 5 0scc基因的转录 ,影响睾酮分泌 ;2 SF 1作为一种核受体 ,可能也是生精过程中重要的转录调控因子 ,调节B型精原细胞向初级精母细胞分化及初级精母细胞第 1次减数分裂过程中特异表达的基因转录过程 ,从而影响青春期小鼠精子发生过程。

左炔诺孕酮对人子宫肌瘤细胞体外增殖与凋亡的影响

目的:建立稳定、成功率高的人子宫肌瘤细胞原代培养方法,探讨不同浓度左炔诺孕酮(levonorgestrel,LNG)对体外培养人子宫肌瘤细胞增殖和凋亡的影响。方法:分别采用酶解法和贴块法原代培养人子宫肌瘤细胞(uterine leiomyoma cell,UtLMC),以α-Actin单抗进行免疫组织化学染色鉴定原代细胞;细胞传代后,加入不同浓度左炔诺孕酮,H-E染色和透射电镜观察细胞的形态学改变,MTT法检测LNG对细胞增殖的调节作用,流式细胞术测定细胞凋亡率,RT-PCR技术分析LNG对人子宫肌瘤细胞凋亡相关基因Bcl-2、IGF-1及Survivin mRNA表达的影响。结果:酶解法和贴块法均成功获得UtLMC,经免疫组化鉴定,纯度达95%以上,并能稳定传12代;5μg/ml左炔诺孕酮对子宫肌瘤细胞无明显作用,当质量浓度达到10μg/ml时可显著抑制细胞增殖,并呈时间、剂量依赖;随着药物浓度的增加,细胞凋亡率亦逐渐升高,与对照组相比有显著性差异(P<0.05);10μg/ml和20μg/ml左炔诺孕酮作用UtLMC后,Bcl-2、IGF-1及Survivin mRNA表达下降。结论:酶解法和贴块法均能获得功能良好的人子宫肌瘤细胞,一定浓度的左炔诺孕酮可抑制其增殖并诱导凋亡,机制与下调Bcl-2、IGF-1及Survivin基因表达有关。

男性特发性不育症与DAZ基因关系的探讨

目的 探讨特发性无精子症和严重少精子症与DAZ基因的关系及意义。方法 应用PCR技术对 5 0例无精子症和严重少精子症患者 (其中无精子症 38例 ,严重少精子症12例 )的外周血细胞进行DAZ基因检测。结果 5 0例中发现 6例 (12 % )有DAZ基因微缺失 (其中无精子症 4例 ,占8% ;严重少精子症 2例 ,占 4 % ) ;SRY基因PCR扩增均为阳性。 5 0例已有生育的正常男性均无DAZ及SRY的微缺失。结论 DAZ为无精子因子 (AZF)的重要候选成分 ,DAZ微缺失可能是引起无精子和严重少精子并造成男性不育的重要原因之一。

多药耐药性人绒毛膜癌裸鼠皮下移植瘤模型的建立及其生物学特性

目的：建立一种耐药性稳定的人绒毛膜癌裸鼠皮下移植瘤模型JAR/VP16/nude,为研究体内肿瘤耐药机制和逆转药物的筛选奠定实验基础。方法：将人绒毛膜癌多药耐药细胞系JAR/VP16接种于裸鼠左侧腋窝皮下,观察成瘤情况及肿瘤生长特性;利用光镜、电镜对移植瘤进行组织学和超微结构观察;逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）检测多药耐药基因mdr1 mRNA的表达;流式细胞术（FCM）分析细胞内罗丹明123（Rhodamine123,Rh123）的潴留情况。结果：裸鼠移植瘤模型构建成功率为98.39%,8~10d开始成瘤,15~20d瘤体长径达1.0~1.5cm;H-E染色及透射电镜观察发现瘤组织形态及细胞超微结构与人绒毛膜癌耐药细胞JAR/VP16相似;RT-PCR和FCM检测表明移植瘤组织mdr1 mRNA表达阳性,且对Rh123有显著的外排作用。结论：以JAR/VP16细胞建立的耐药性绒毛膜癌裸鼠移植瘤模型,保持了耐药性人绒毛膜癌细胞JAR/VP16的组织学特征和多药耐药性,为耐药性人绒毛膜癌耐药机制和逆转的研究提供了理想的动物模型。

DAZ及DAZH基因与精子发生的相关性分析

ＤＡＺ基因（ｄｅｌｅｔｅｄｉｎａｚｏｏｓｐｅｒｍｉａ）是无精子因子（ＡＺＦ）的重要候选成分，它的缺失可致无精子或严重少精子症。人第３号染色体上存在着ＤＡＺ的同源基因ＤＡＺＨ（ＤＡＺｈｏｍｏｌｏｇｕｅ），为探讨ＤＡＺ和ＤＡＺＨ基因在精子发生中的作用，我们用聚合酶链反应（ＰＣＲ）方法检测了６６名正常生育男性和９０例原发性不育男性基因组ＤＮＡ的ＤＡＺ、ＤＡＺＨ基因。结果：原发性不育男性中１２例ＤＡＺ缺失（无精子症８例，严重少精子症４例）；正常男性ＤＡＺ无一缺失；在正常男性和不育男性中均有ＤＡＺＨ缺失。结果进一步证实ＤＡＺ为ＡＺＦ的候选成分，而ＤＡＺＨ基因与精子发生似无直接的相关性。

4’-甲醚-黄芩素逆转人绒毛膜癌耐药细胞株多药耐药性的相关机制研究

目的:探讨4’-甲醚-黄芩素(4’-M-S)逆转人绒毛膜癌耐药细胞株JAR/VP16多药耐药性的可能机制。方法:采用流式细胞术测定4’-M-S作用前后耐药细胞内罗丹明(Rh123)潴留量的变化,以检测4’-M-S对P-糖蛋白(P-gp)功能的影响;用半定量逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)检测多药耐药基因mdr1 mRNA的表达,并进一步采用Western blot及免疫组织化学法测定mdr1基因产物P-gp的表达。结果:流式细胞术结果表明,20μg/ml4’-M-S可明显增加耐药细胞内潴留的Rh123浓度;RT-PCR及Western blot结果显示,4’-M-S可抑制耐药细胞中mdr1 mRNA和P-gp的表达;免疫组化实验显示,4’-M-S处理后,耐药细胞中P-gp的表达下降,表现为细胞膜上阳性颗粒数量减少、着色变浅。结论:4’-M-S对人绒毛膜癌耐药细胞株多药耐药性的逆转,与抑制mdr1 mRNA及其产物P-gp的表达、增加细胞内化疗药物的浓度有关。

不孕症双向转诊体系的建设

目的:实践和推广实用、合理的不孕不育诊治双向转诊体系,解决卫生系统中双向转诊体系建设问题。方法:建立不孕不育诊治规范流程;建立不孕不育病因初筛临床路径;运用电子化管理数据库系统;多次的学习班培训,为期3个月的进修;巡回讲座;专家出诊;设立绿色通道;设立不孕不育门诊示范点。结果:2006—2008年8个门诊点不完全统计转诊患者573人次,转诊率8.8%(573/6 501)。2009年10个门诊点转诊患者447人次,转诊率2.88%(447/15 527)。2005—2010年9月通过绿色通道接受转诊患者648人次;专家出诊44次,接诊1 240人次;实际参加为期3个月进修培训人员133人次;学习班举行16次,参加人员1 223人;设立不孕不育门诊点27家;参加数据库系统学习32家单位。结论:不孕症双向转诊体系的建设取得了很好的效果,已经在江苏省内建立了不孕不育规范化诊治流程,建立了不孕不育病因初筛临床路径,对减少不孕症患者来回奔波、减少医疗开支有切实可行的意义。

2例46,XX性发育睾丸疾病报道并文献复习

目的:探讨46,XX性发育睾丸疾病患者的表型、病因病机及其分子生物学特点。方法:对2例46,XX性发育睾丸疾病患者进行病史采集,盆腔B超扫描,染色体核型分析,PCR扩增法检测SRY、YRRM1、DYS240、DAZ基因。结果:两例患者均表现为小睾丸,无精子,第二性征较差。盆腔B超探查未发现女性内生殖器官。两患者染色体核型均为46,XX,且SRY(+),其中1例YRRM1(+)。结论:对性发育异常患者进行染色体核型分析和SRY基因检测,有利于了解该类患者的遗传学病因,为明确诊断和治疗提供科学依据。

肝癌细胞前列腺素E_2受体表达和分布的研究

目的:基于肝癌细胞(肝细胞癌细胞和胆管上皮癌细胞)对PGE2的不同反应性,研究Hep3B、HuH7、SG231和HuCCT1肝癌细胞株前列腺素E2受体的表达类型和分布定位。方法:体外培养肝细胞癌细胞株(Hep3B,HuH7)和胆管上皮癌细胞株(SG231,HuCCT1),分别给予不同浓度的外源性PGE2处理,以WST-1细胞增殖实验检测肿瘤细胞增殖率;以RT-PCR实验检测上述细胞4种PGE2受体(EP1、EP2、EP3和EP4)的mRNA表达情况;采用上述肝癌细胞的细胞涂片或细胞爬片进行荧光免疫细胞化学实验,于荧光显微镜和共聚焦显微镜下观察上述4种EP受体蛋白的表达和定位分布。结果:WST-1细胞增殖实验结果显示PGE2可以促进Hep3B和HuH7细胞的生长,但对胆管上皮癌细胞(SG231、HuCCT1细胞)则表现为生长抑制作用;RT-PCR和荧光免疫细胞化学实验结果表明Hep3B、HuH7、SG231和HuCCT1细胞株均有4种EP受体的表达;激光共聚焦结果显示4种EP受体不仅有胞浆、胞膜定位,而且部分在胞核也有表达,其中EP4受体的表达主要定位于细胞核。结论:Hep3B、HuH7、SG231和HuCCT1,4种肝癌细胞株均可以表达EP1、EP2、EP3和EP4受体,且受体的细胞内定位不同。肝癌细胞对前列腺素E2的反应性可能与EP受体的定位以及不同的细胞内信号转导通路激活有关。

猪体外成熟卵母细胞的卵丘扩散与胚胎发育能力的相关性

目的 探讨卵母细胞体外成熟过程中卵丘扩散与其体外受精后胚胎发育能力的关系。 方法 取猪卵丘 卵母细胞复合体 (COCs)在体外进行成熟、受精和培养 ,在体外成熟培养液中添加不同直径卵泡 (<2 ,2～ 5和 >5mm)的不同浓度 (15%、5% )卵泡液。 结果 在含卵泡液的成熟培养液中培养 48h ,卵泡液明显抑制了COCs的卵丘扩散 (P <0 .0 5) ,但不影响第一极体的排出 ;COCs成熟培养 2 4h后 ,移入不含卵泡液的成熟培养液中继续培养 2 4h ,卵丘扩散显著高于对应的 48h培养组 (P <0 .0 5) ,但第一极体的排出率无显著差异 ;体外成熟过程中COCs扩散的卵丘面积与其受精后的胚胎发育能力 (发育到 2～ 4细胞、>4细胞和桑葚胚 /囊胚的百分率 )呈显著正相关 (P =0 .0 0 58,0 .0 0 0 1和 0 .0 3 4 8)。 结论 卵泡液对COCs的卵丘扩散有抑制作用 ,这种抑制作用与卵泡液的作用时间相关 ;

小鼠睾丸组织培养时间及温度对精子生成影响的观察

为建立小鼠睾丸组织短期培养方法，对成年小鼠睾丸组织进行培养。结果显示：在３４℃条件下培养２４小时，小鼠睾丸组织各级生精细胞和间质细胞发育正常。培养４８小时，曲精小管基底部细胞发生增殖。培养７２小时，曲精小管基底层增殖的细胞向管腔面迁移。在３７℃条件下，生精上皮细胞发生脱落和崩解。结果提示，本研究建立的小鼠睾丸组织短期培养方法能有效减少曲精小管微环境的改变。