结核分枝杆菌Rv2647蛋白对肺组织损伤效应的初步研究

目的:通过噬菌体重组技术分别构建结核分枝杆菌Rv2647基因的敲除株和回补株以及过表达Rv2647的耻垢分枝杆菌(Mycobacterium smegmatis,Ms),评估结核分枝杆菌Rv2647蛋白对模型鼠肺组织的损伤效应。方法:构建同源交换位点并整合到结核分枝杆菌噬菌体基因组,获取噬菌粒并将其导入Ms,构建具有同源交换位点的重组噬菌体。体外扩增获得高滴度重组噬菌体并转染结核分枝杆菌(H37Rv),37℃静置培养28 d,挑取单克隆进行PCR验证,获得Rv2647基因敲除株(H37RvΔRv2647)。PCR扩增Rv2647基因并通过无缝克隆分别将其整合到载体pMV361和pMV261多克隆位点处,获得阳性质粒后分别电转化H37RvΔRv2647和Ms,获得结核分枝杆菌回补株(H37RvΔRv2647::Rv2647)及过表达Rv2647的耻垢分枝杆菌(Ms::Rv2647)。分别以H37Rv、H37RvΔRv2647、H37RvΔRv2647::Rv2647、Ms及Ms::Rv2647的菌液经气管攻击C57BL/6小鼠,分别比较H37Rv(30 d)与Ms(7 d)模型鼠的存活率、肺组织细菌负荷及肺组织病理损伤程度。结果:PCR结果显示,H37RvΔRv2647中Rv2647基因缺失,而H37RvΔRv2647::Rv2647及Ms::Rv2647中Rv2647基因皆存在。H37RvΔRv2647、H37Rv及H37RvΔRv2647::Rv2647组模型鼠30 d存活率分别为100.00%、83.33%及83.33%;Ms和Ms::Rv2647组模型鼠的7 d存活率分别为100.00%和83.33%;H37RvΔRv2647组模型鼠肺组织细菌负荷(lgCFU)为(3.40±0.18),显著低于H37Rv组(3.86±0.15,P<0.001)和H37RvΔRv2647::Rv2647组(3.80±0.16,P<0.01);H37RvΔRv2647组模型鼠肺组织炎症面积(%)为(4.37±3.06),显著低于H37Rv组(62.76±14.24,P<0.001)和H37RvΔRv2647::Rv2647组(67.37±0.45,P<0.001);Ms组模型鼠肺组织lgCFU为(2.53±0.16),显著低于Ms::Rv2647组(2.81±0.13,P<0.01);Ms组模型鼠肺组织炎症面积(%)为(5.71±1.29),显著低于Ms::Rv2647组(33.13±13.84,P<0.05)。结论:成功构建了结核分枝杆菌Rv2647基因敲除株(H37RvΔRv2647)及回补株(H37RvΔRv2647::Rv2647)以及过表达Rv2647的耻垢分枝杆菌(Ms::Rv2647)。Rv2647蛋白可能通过抑制宿主对结核分枝杆菌的清除,加重了模型鼠肺组织病理损伤。