新型冠状病毒N亚基因组荧光定量PCR检测方法的建立及初步应用

目的建立一种快速检测新型冠状病毒N亚基因组(SgN)的方法,探讨其在新型冠状病毒肺炎病例及环境样本中的应用价值。方法根据全球共享流感数据库(GISAID)公布的新型冠状病毒全基因组序列设计SgN特异性引物和探针,优化退火温度、引物与探针浓度等反应条件,建立新型冠状病毒SgN荧光定量PCR检测方法,绘制标准曲线,评价该方法的灵敏性、重复性和特异性。采用建立的病毒SgN荧光定量PCR检测方法检测21份环境和351份临床样本,并选取25份SgN阳性样本进行病毒分离以评估该检测方法的应用效果。结果 SgN的引物和探针对新型冠状病毒具有良好特异性。初步建立的病毒SgN荧光定量PCR检测方法最低检测限为1.5×102copies/ml,变异系数小于1%。372份样本的gRNA阳性率为97.04%(361/372),gRNA阳性样本中阳性环境样本和阳性临床样本的SgN阳性率分别为36.84%(7/19)和49.42%(169/342)。其中野生型毒株样本的SgN阳性率及拷贝数均比德尔塔(Delta)毒株低。在25份SgN阳性样本中,采样时间在5 d内的12份样本均分离到病毒;13份采样时间在12 d以上的样本未发生细胞病变。结论成功建立了一种检测新型冠状病毒SgN的荧光定量PCR方法,该方法的灵敏度、特异性和重复性均较好。