肠道病毒71型诱导不同细胞焦亡的研究

目的探讨肠道病毒71型(EV-A71)感染不同细胞后细胞形态变化及诱导细胞焦亡的差异。方法选用2株EV-A71毒株(分别分离自重症及普通病例)分别感染人横纹肌肉瘤细胞(RD细胞)、人喉表皮样癌细胞(Hep_2细胞)、人脑星形胶质瘤细胞(SW1088细胞)及人神经母细胞瘤细胞(SH-SY5Y细胞)48 h后,观察细胞形态,并用流式细胞仪检测含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶-1(caspaswl)活性。结果RD、SW1088及SH-SY5Y细胞感染EV-A7148 h后,感染组细胞出现明显的细胞病变效应(cytopathic effect,CPE),caspase-1活性细胞比例显著高于对照组,且分离自重症病例的EV-A71诱导的caspase-1活性显著高于分离自普通病例的EV-A71,分离自重症、普通病例的EV-A71诱导的caspase-1活性细胞及对照组的caspase-1活性细胞比例分别为,RD细胞:99.01%vs80.94%vs 16.75%;SW1088细胞:93.13%vs79.17%vs9.48%;SH-SY5Y细胞:92.95%vs68.05%vs13.37%,P均<0.001。但Hep-2细胞感染48 h后未见明显CPE,且分离自重症及普通病例的EV-A71诱导的caspas&l活性细胞比例与对照组比较差异无统计学意义(24.98%vs23.78%vs27.53%,P>0.05)。结论EV-A71能诱导RD、SW1088及SH-SY5Y细胞发生caspase-1介导的焦亡,而不能诱导Hep^2细胞发生焦亡,且分离自重症病例的EV-A71诱导细胞焦亡的能力显著高于分离自普通病例的EV-A71。

新型冠状病毒N亚基因组荧光定量PCR检测方法的建立及初步应用

目的建立一种快速检测新型冠状病毒N亚基因组(SgN)的方法,探讨其在新型冠状病毒肺炎病例及环境样本中的应用价值。方法根据全球共享流感数据库(GISAID)公布的新型冠状病毒全基因组序列设计SgN特异性引物和探针,优化退火温度、引物与探针浓度等反应条件,建立新型冠状病毒SgN荧光定量PCR检测方法,绘制标准曲线,评价该方法的灵敏性、重复性和特异性。采用建立的病毒SgN荧光定量PCR检测方法检测21份环境和351份临床样本,并选取25份SgN阳性样本进行病毒分离以评估该检测方法的应用效果。结果 SgN的引物和探针对新型冠状病毒具有良好特异性。初步建立的病毒SgN荧光定量PCR检测方法最低检测限为1.5×102copies/ml,变异系数小于1%。372份样本的gRNA阳性率为97.04%(361/372),gRNA阳性样本中阳性环境样本和阳性临床样本的SgN阳性率分别为36.84%(7/19)和49.42%(169/342)。其中野生型毒株样本的SgN阳性率及拷贝数均比德尔塔(Delta)毒株低。在25份SgN阳性样本中,采样时间在5 d内的12份样本均分离到病毒;13份采样时间在12 d以上的样本未发生细胞病变。结论成功建立了一种检测新型冠状病毒SgN的荧光定量PCR方法,该方法的灵敏度、特异性和重复性均较好。

新型冠状病毒亚基因组RNA荧光重组酶介导等温扩增检测方法的建立及评价

目的 建立新型冠状病毒(SARS-CoV-2)亚基因组RNA(sgRNAs)荧光重组酶介导等温扩增(reverse-transcription recombinase-aided amplification,RT-RAA)检测方法。方法 根据SARS-CoV-2的5′-leader和7a、N基因序列设计特异性等温扩增引物和探针,在39℃等温条件下,30 min内对SARS-CoV-2的sgRNAs进行快速检测,并对该方法的灵敏度、特异度及与实时荧光定量PCR(real-time fluorescence quantitative PCR,real time PCR)法的一致性进行评价。结果 该方法检测限可达到20拷贝/μl,且与其他呼吸道病原体均无交叉反应,具有良好的灵敏度和特异度;与荧光定量PCR法相比,2种检测方法一致性较好(κ=0.762,P<0.001)。结论 本文建立的荧光RT-RAA法可用于SARS-CoV-2 sgRNAs的快速检测,对于临床样本感染性的快速诊断有重要意义。

新型冠状病毒非结构蛋白1重要变异对其与核糖体40S亚单位结合能力的影响

目的 探讨新型冠状病毒(SARS-CoV-2)非结构蛋白1(NSP1)重要变异对其与核糖体40S亚单位结合能力的影响.方法 基于生物信息学方法,选取可能影响与核糖体40S亚单位结合能力的NSP1氨基酸突变位点(D152A、E155A、F157S、T170S和R171L),PSIPRED在线工具分析突变体的二级结构,mCSM-NA预测其与核糖体的结合能力,DynaMut webserver分析突变对蛋白稳定性的影响;构建NSP1突变体,转染HEK-293T细胞,利用免疫共沉淀检测NSP1突变体与核糖体40S亚单位的结合能力,SUnSET实验评价突变体对蛋白合成率的影响;双荧光素酶报告基因实验、ELISA和RT-PCR方法进一步评价NSP1蛋白关键位点突变对IFN-β表达的影响.结果 生物信息预测5种突变体均可改变蛋白二级结构,其中F157S和R171L可降低NSP1与核糖体40S的结合能力.实验表明F157S和R171L突变显著减弱了 NSP1与核糖体40S的结合能力,增加了细胞总蛋白合成、IFN-β荧光素酶活性、细胞内IFN-β mRNA的表达及上清中IFN-β表达量(P<0.05).结论 NSP1 F157S和R171L突变显著减弱了 NSP1与核糖体40S的结合能力,增强了 IFN-1的反应,提示NSP1蛋白在免疫调节中起重要作用.