基于CRISPR/Cas9基因编辑技术构建PD-L1-GFP报告基因HT29细胞株

利用CRISPR/Cas9基因编辑技术和同源重组技术在PD-L1基因的特定位置敲入绿色荧光蛋白(GFP)序列,构建含有PD-L1-GFP报告基因的结肠癌细胞(HT29)稳定细胞株。根据CRISPR-Cas9靶点设计原则,针对PD-L1基因终止密码子设计两对sgRNA,退火形成双链后连接至Lenti-V2空载质粒中,转化培养后提取质粒并测序验证。对于正确的Lenti-V2-sgRNA重组质粒,T7E1酶切验证其基因编辑效率。根据靶点位置设计左同源臂+GFP+右同源臂序列合成Donor片段,双酶切后连接至pUC19,重组载体转化扩增后同样进行质粒提取和测序验证。将验证成功的Lenti-V2-sgRNA和pUC19-donor-GFP共转染HT29细胞,荧光显微镜检测GFP表达情况,菌落PCR及基因测序验证GFP报告基因的靶向插入效果。经酶切和测序鉴定,靶向编辑PD-L1的Cas9载体Lenti-V2-gRNA和含GFP基因的Donor质粒pUC19-donor-GFP构建成功。两个重组质粒转染HT29细胞后,显微观察、多克隆验证、单克隆筛选及鉴定结果显示,GFP成功转入HT29细胞并进行了表达,经有限稀释法筛选出的单克隆细胞荧光均一,且与对照组相比,阳性细胞克隆的基因组PCR均检测到特异条带,表明在PD-L1终止密码子前成功插入了GFP片段,细胞株构建成功。通过基因编辑技术成功构建了稳定表达PD-L1-GFP报告基因的HT29结肠癌细胞株,建立了一个可以直观在细胞上观察PD-L1是否表达以及表达的强弱程度的系统,为后期体内外筛选调控PD-L1的上游新靶点及药物奠定了基础。

生物信息学及分子模拟在蛋白质降解靶向嵌合体(PROTAC)中的研究

蛋白质降解靶向嵌合体(proteolysis targeting chimera,PROTAC)是一种利用泛素−蛋白酶体系统(ubiquitin proteasome system,UPS)对靶标蛋白进行降解的药物开发技术。与传统小分子药物通过“占位驱动”作用模式调控蛋白质活性的方式不同,PROTAC通过形成稳定的靶蛋白-PROTAC-E3泛素连接酶三元复合物,并利用泛素−蛋白酶体系统降解靶标蛋白而发挥作用。然而,目前只有少数E3泛素连接酶被用到PROTAC分子设计中,PROTAC可靶向的靶标蛋白空间也有待进一步拓展;另一方面,靶蛋白-PROTAC-E3泛素连接酶的三元复合物晶体结构解析难度较大,计算模拟方法为构建三元复合物模型提供了有效的工具。基于此,本文介绍了生物信息学在拓展E3泛素连接酶及扩大靶标蛋白空间方面的研究进展,总结了计算模拟在PROTAC三元复合物结构模拟中的方法研究,并探讨了PROTAC技术的发展趋势。

邻二碘芳烃和氢化钠产生芳炔用于硫醇的邻碘芳基化反应

该方法使用廉价易得的试剂邻二碘芳烃和氢化钠生成苯炔,然后与硫醇发生反应,简单高效地合成邻碘芳基硫醚.值得注意的是,在反应中没有观察到像过渡金属催化那样得到的二硫醚副产物.该方法操作简单,条件温和,底物范围广泛,很多情况下都给出较高收率的产物.

基于双重信号放大技术的非洲猪瘟病毒快速现场核酸检测方法的开发与应用

本研究开发了一种新的基于双重信号放大技术的非洲猪瘟病毒(ASFV)核酸检测方法,旨在提供快速、高灵敏度和高特异性的现场检测解决方案,并已进行规模化测试。该方法采用特定引物和重组酶复合体靶向ASFV基因序列,通过T7 RNA聚合酶在恒温下快速扩增RNA。扩增的RNA与荧光标记的DNA探针杂交后,经DSN酶水解释放荧光信号,放大探针检测逾1000倍。采用不同的引物、探针和试剂组合,在标准质粒和模拟样本上进行了灵敏度、特异性和污染防控的评价,并简化了样品处理步骤。结果表明,该方法能够在25 min内稳定且特异地检测到5~10 copies的靶标基因,与qPCR相比降低了污染风险。在393个临床样本的检测中,155个阳性和238个阴性样本的检测结果均符合预期,准确率达100%。本研究成功建立了一种适用于现场检测ASFV的双重信号放大核酸检测方法,为ASFV的临床监测和诊断提供了可靠的技术支持。