CRISPR/Cas9基因编辑技术在肿瘤耐药研究中的应用进展

成簇规律间隔短回文重复序列/CRISPR相关核酸酶9(CRISPR/Cas9)基因编辑系统是存在于细菌和古生细菌中的一种抵御外源DNA入侵的适应性免疫反应系统。与传统的锌指核酸酶(ZFN)和转录激活样因子效应物核酸酶(TALEN)基因编辑技术相比,CRISPR/Cas9操作更加简便、高效。目前,该技术已在肿瘤耐药研究中得到广泛应用,包括乳腺癌和白血病耐药等诸多方面。CRISPR/Cas9技术的应用虽仍存在脱靶效应等问题,但其应用前景非常广阔。本文就其在肿瘤耐药研究方面的应用进行综述。

负载gp96－Ki67 280-288复合物的树突状细胞疫苗对骨肉瘤的抗肿瘤效应体内实验研究

目的：研究HSPgp96与Ki67280－288复合物在体内的特异性抗肿瘤作用机制。方法设计分组对照实验，分别给予gp96－Ki67280－288复合物、Ki67280－288多肽、HSPgp96、PBS免疫HLA－A倡0201转基因小鼠。 MTT法检测小鼠淋巴细胞增殖情况，ELISA法检测其诱导的细胞毒性T细胞（ CTL）分泌干扰素（ IFN）－γ水平，乳酸脱氢酶（LDH）释放试验检测所诱导的CTL对U2OS骨肉瘤细胞的杀伤活性，同时在U2OS骨肉瘤动物模型上观察gp96－Ki67280－288复合物修饰后的树突状细胞（DC）所诱导产生的CTL对肿瘤生长及动物生存期的影响。结果gp96－Ki67280－288复合物免疫的小鼠的淋巴细胞表现出最强的增殖能力，淋巴细胞上清液中的IFN－γ水平较其他组升高（P＜0．05）；LDH释放实验表明，随着效靶比的提高，各组淋巴细胞对U2OS细胞的杀伤率相应增高（P＜0．05），在效靶比为40∶1的时候最高，gp96－Ki67280－288组的杀伤率高于HSPgp96组、Ki67组和PBS组（P＜0．05）。荷瘤裸鼠实验结果显示，从第12天以后，gp96－Ki67280－288组小鼠肿瘤体积明显小于其他组（P＜0．05）；gp96－Ki67280－288组的抑瘤率高于HSPgp96组和Ki67组（P＜0．05），较其他3组表现出更长的生存期（P＜0．05）。结论 gp96－Ki67280－288复合物能很好地修饰树突状细胞，使树突状细胞有效地提呈抗原，并诱导抗原特异性抗肿瘤免疫反应，具有很强的体内抗肿瘤作用。

PD1/PD-L1阻断治疗肿瘤的影响因素、疗效预测标志物及联合治疗

最近,程序性死亡之受体1及其配体(PD1/PD-L1)抗体在不同类型肿瘤的临床治疗中取得了较好效果,使部分患者的病情得到了长期控制。然而,多数患者并未从治疗中获益。本文将综述影响PD1/PD-L1阻断治疗的关键因素,评价疗效预测标志物的可靠性,并分析基于PD1/PD-L1阻断治疗的不同联合治疗方案。

以肿瘤相关免疫细胞为标志物预测和评估抗PD-1/PD-L1疗效的研究进展

研发生物标志物以准确预测或评估抗PD-1/PD-L1治疗的疗效具有重要意义。T细胞、B细胞、巨噬细胞、DC、中性粒细胞、NK细胞和髓源性抑制细胞等肿瘤相关免疫细胞通过多种途径影响肿瘤免疫治疗的疗效。近年来的研究发现,有些免疫细胞可以作为预测指标,在治疗前预判肿瘤患者能否对抗PD-1/PD-L1治疗产生应答;有些免疫细胞可以作为疗效评估指标,在治疗早期判断患者从长期治疗中获益的可能性。本文主要就上述肿瘤相关免疫细胞对于肿瘤免疫治疗的影响以及预测作用进行综述。

基于HLA-E功能特点的肿瘤免疫治疗新策略

人类白细胞抗原-E(HLA-E)在多种肿瘤中呈高表达,其与肿瘤患者预后的关系呈现肿瘤类型依赖性。HLA-E主要通过与NK细胞或T细胞上的激活性(NKG2C)或抑制性(NKG2A)受体结合,在调控抗肿瘤免疫应答中发挥重要作用。基于此,靶向HLA-E/NKG2A以阻断HLA-E与NKG2A的相互作用或抑制HLA-E表达,有望成为增强抗肿瘤免疫应答的新策略。鉴于HLA-E的功能特点设计增强型或通用型的T/NK细胞过继免疫疗法,有望提高过继免疫细胞疗法的治疗效果,具有良好的研发和临床应用前景。如何将靶向HLA-E或NKG2A的疗法与其他免疫疗法有效联合,实现更精准的免疫治疗以提高临床治疗效果是目前该方面研发和应用需要解决的难题之一。

负载gp96-ki67复合物的DC疫苗对骨肉瘤的抗肿瘤效应体外实验研究

目的负载gp96-ki67复合物的树突状细胞（DC）疫苗对骨肉瘤细胞系U2—OS的杀伤作用及其机制。方法用抗原肽复合物gp96-Ki67、gp96、Ki67、PBS分别负载DC，然后与同源的T淋巴细胞共培养7天，流式细胞仪检测各组T淋巴细胞分泌穿孔素情况；ELISA法检测各组释放γ-干扰素（INF-γ）浓度；LDH释放实验及CFSE／7AAD双标法检测体外对骨肉瘤细胞系U2—OS的杀伤效率。结果gp96-Ki67组T淋巴细胞分泌穿孔素、IFN-γ浓度最强，与gp96组、Ki67组、PBS组比较，差异均有统计学意义（P〈0．05）。各组T淋巴细胞对U2-OS细胞的杀伤率随着效靶比的增加而提高，在效靶比为40：1时，各组的杀伤率最高；gp96-Ki67组杀伤作用最强，与Ki67组、gp96组、PBS组比较，差异有统计学意义（P〈0．05）。结论gp96-Ki67复合物能很好地修饰DC，使DC有效地提呈抗原，提高T淋巴细胞分泌穿孔素和IFN-γ的浓度，在体外对骨肉瘤有很强的抗肿瘤作用。

受体酪氨酸激酶AXL与肿瘤免疫治疗

AXL是受体酪氨酸激酶TAM(TYRO3-AXL-MERTK)家族中的一员,被认为是一种癌基因,不仅在多种癌症中高表达,而且也表达于包括NK细胞、树突状细胞(DC)、T细胞在内的多种免疫细胞,且可以通过调节其下游的信号通路影响免疫细胞的发育及功能。AXL作为一种"免疫检查点"参与抗肿瘤免疫反应的调控,或将成为肿瘤免疫治疗的新靶点。本文主要介绍AXL在不同免疫细胞中的生物学功能,以及目前靶向AXL相关药物的研究进展,以期为研发AXL靶向药物和制定联合用药策略提供新思路。

FBXO22基因在肾癌细胞侵袭中的作用及相关机制研究

目的：观察小干扰RNA（siRNA）沉默FBXO22基因对人肾癌细胞株（786－O、ACHN）细胞迁移、侵袭能力的影响。方法分别用siRNA－Ctrl和siRNA－FBXO22小干扰RNA转染人肾癌细胞株786－O和ACHN细胞；Western blot实验检测FBXO22蛋白表达量，CCK－8实验检测FBXO22基因对肾癌细胞增殖的影响，Transwell细胞迁移实验和侵袭实验检测沉默FBXO22基因后对786－O和ACHN肾癌细胞迁移能力和细胞侵袭能力的影响，明胶酶谱实验检测细胞分泌基质金属蛋白酶（ MMPs）的能力。结果转染FBXO22 siRNA后肾癌786－O及ACHN细胞的FBXO22表达下调，迁移和侵袭能力提高，分泌MMP－9的能力升高，但对肾癌细胞增殖无影响。结论沉默FBXO22基因后，可以增加MMP－9的分泌，从而激活MMP－9信号通路增强肾癌786－O细胞及ACHN细胞的迁移和侵袭的能力。

基于BCMA突变体构建BCMA CAR-T细胞体外杀伤功能评价模型

目的:为解决野生型B细胞成熟抗原(BCMA)被γ分泌酶切割导致表达不稳定的问题,构建抵抗γ分泌酶切割的BCMA突变体并构建靶细胞,用于评价BCMA CAR-T细胞的杀伤功能。方法:将野生型BCMA的穿膜域替换为人CD8α穿膜域,构建抵抗γ分泌酶切割的BCMA突变体(BCMA-CD8αTM),构建过表达该突变体的U266(U266^(BCMA Mut))、K562(K562^(BCMA Mut))、SKOV3(SKOV3^(BCMA Mut))和CHO(CHO^(BCMA Mut))细胞;构建装载NFAT-EGFP报告基因的BCMA CAR Jurkat细胞(BCMA-CAR-Jurkat-Reporter)与U266^(BCMA Mut)细胞共培养,采用FCM检测该细胞中EGFP表达水平以指示NFAT激活水平,荧光素酶法检测BCMA CAR-T细胞对Luciferase标记的K562^(BCMA Mut)细胞的杀伤作用,实时无标记动态细胞分析技术(RTCA)检测BCMA CAR-T细胞对SKOV3^(BCMA Mut)和CHO^(BCMA Mut)细胞的杀伤作用。结果:应用γ分泌酶抑制剂LY411575抑制γ分泌酶活性,显著增强野生型U266细胞表面BCMA表达水平,平均荧光强度上调10倍以上;但撤除抑制剂后BCMA表达水平逐渐降低(P<0.01);BCMA-CD8αTM突变体可抵抗γ分泌酶的切割作用,在U266细胞表面稳定表达(P>0.05);U266细胞及过表达BCMA-CD8αTM的U266细胞与BCMA-CAR-Jurkat-Reporter细胞共培养后都可激活Reporter系统、增强EGFP表达,但该效应在BCMA-CD8αTM过表达的U266细胞中更显著(P<0.01);BCMA-CD8αTM在BCMA表达阴性的K562、SKOV3和CHO 3种靶细胞中成功过表达,且在LY411575处理下该突变体的表达水平仅有小幅度升高;荧光素酶法检测结果显示,不同效靶比下,BCMA CAR-T细胞均可特异、高效杀伤过表达BCMA-CD8αTM的K562细胞;RTCA结果显示,不同效靶比下,BCMA CAR-T细胞均可有效识别、杀伤过表达BCMACD8αTM的SKOV3和CHO细胞,但同等效靶比下的Mock-T细胞无此效应。结论:本实验构建的BCMA-CD8αTM突变体能够抵抗γ分泌酶的切割,在多种靶细胞表面稳定表达,为评价BCMA CAR-T细胞体外杀伤的有效性和特异性提供多种检测手段。

NORE1基因在肾透明细胞癌细胞迁移侵袭和血管生成中的作用及相关机制的研究

目的探讨NORE1基因过表达对肾透明细胞癌细胞迁移侵袭及血管生成的影响及其分子作用机制。方法利用NORE1过表达质粒和对照组质粒,分别转染人肾透明细胞癌786-O和ACHN细胞,Western blot检测细胞转染效率,Transwell细胞迁移实验和侵袭实验检测细胞迁移和侵袭的能力,体外血管生成实验观察其血管生成能力,Western blot检测NORE1基因过表达后肾癌细胞中基质金属蛋白酶(MMPs)的蛋白表达水平。结果转染NORE1过表达质粒后,肾透明细胞癌786-O、ACHN细胞中NORE1表达量增加。NORE1基因过表达后肾透明细胞癌细胞迁移及侵袭能力减弱,血管生成能力减弱,差异均具有统计学意义(P<0.001)。NORE1过表达组肾透明细胞癌细胞中MMP-9表达较对照组显著下降,而两组间MMP-2表达水平无显著性差异。结论肾透明细胞癌细胞中NORE1基因可以通过调节MMP-9的表达影响细胞的迁移侵袭及血管生成。

自噬在肺癌放射治疗中的作用

自噬是细胞固有的一种物质降解再利用过程,不仅在维持细胞内环境稳定方面发挥重要作用,也在肿瘤治疗领域有着广泛的影响。肺癌是最常见的一种恶性肿瘤,放射治疗作为肺癌的重要治疗手段之一,可以显著改善患者预后。越来越多的证据表明自噬对肺癌放射治疗效果具有重要影响。本文就自噬在肺癌放射治疗中的作用作一综述。

腹腔镜下腹膜外造瘘与腹膜内造瘘的对照研究及腹膜外造瘘的技巧

目的总结腹腔镜下腹膜外造瘘的优势及腹膜外造瘘的技术要点。方法回顾性研究徐州医科大学附属医院胃肠外科2010年1月至2014年1月间共95例行腹腔镜Miles手术或Hartman手术患者的临床资料，其中中低位直肠癌77例，肛管癌14例，高位直肠癌4例。腹膜外造瘘70例（A组），腹膜内造瘘25例（B组），随访时间2年，比较两种造瘘方式中出现造瘘旁疝等并发症的发生率。结果患者均在腹腔镜辅助下完成直肠肿瘤切除及永久性乙状结肠造瘘，无中转开腹，无手术死亡。腹膜外造瘘1例出现造瘘口旁疝，腹膜内造瘘4例出现造瘘口旁疝，差异有统计学意义（P〈0．05）。结论腹腔镜下腹膜外乙状结肠造瘘简单易行，并可减少术后造瘘口旁疝的发生率。

曲妥珠单抗的耐药机制及其逆转策略

曲妥珠单抗(trastuzumab;商品名为Herceptin,赫赛汀)是靶向人表皮生长因子受体2(human epidermal growth factor receptor 2,HER2)的人源化单克隆抗体,与化疗药物联用可显著提高患者的无进展生存期。然而,曲妥珠单抗的原发性和获得性耐药严重制约了其临床疗效及应用。PI3K/AKT/m TOR信号通路的异常活化、HER家族成员间的相互作用、药物压力下代偿性生存信号的激活、肿瘤干细胞表型形成等均可能成为曲妥珠单抗耐药的重要机制。随着曲妥珠单抗耐药机制研究的不断深入,克服耐药的治疗手段也越来越丰富。有研究表明,曲妥珠单抗与其他靶向HER2胞外域的单克隆抗体或靶向其他HER家族成员的抗体类药物联用可增强曲妥珠单抗的疗效。应用PI3K/AKT/m TOR信号通路的小分子抑制剂或耐药相关促生存信号通路的特异性抑制剂可有效逆转耐药发生,延长患者的疾病无进展生存期。深入研究曲妥珠单抗耐药的机制,不断探索逆转耐药的治疗策略,可为乳腺癌个性化治疗方案的建立提供依据。本文将对曲妥珠单抗耐药机制及克服耐药的研究进展做一介绍。

Cullinl基因在肾癌细胞增殖及迁移侵袭中的作用

目的应用小干扰RNA（siRNA）干扰肾癌786-0细胞及ACHN细胞Cullinl（Cull）基因的表达，探讨Cull基因在人肾癌细胞增殖、迁移和侵袭中的作用。方法用CullsiRNA和ControlsiRNA转染人肾癌786-0及ACHN细胞，转染24h后行CCK-8细胞增殖实验，转染48h后行迁移与侵袭实验，转染48h后提取蛋白，Westernblot检测Cull蛋白及基质金属蛋白酶2（MMP-2）和MMP-9蛋白的表达。结果转染CullsiRNA后，肾癌786-0及ACHN细胞的Cull表达下降明显，肾癌细胞的增殖能力、迁移能力及侵袭能力下降，MMP-2及MMP-9表达下降。结论干涉Cull基因可以抑制肾癌786-0细胞及ACHN细胞的增殖，并通过降低肾癌细胞内MMP-2和MMP-9的表达来抑制肾癌细胞迁移和侵袭。

基于CRISPR/Cas9技术构建多重sgRNA实现在人原代T细胞中敲除ADRB2基因

目的:利用CRISPR/Cas9技术,通过多重sgRNA策略,实现在人原代T细胞中ADRB2基因的快速、高效敲除。方法:针对ADRB2基因5’端组成性外显子设计6条sgRNA,通过与pGL3-U6-sgRNA-PGK-Puro载体连接,构建6个单一sgRNA表达载体,分别与Cas9表达载体瞬时转染HEK-293T细胞;通过T7EN I酶切检测其介导的切割效率,筛选出4条高活性的配对sgRNA。继而将4条sgRNA有序串联克隆至pGL3-U6-sgRNA-ccdB-EF1α-Puro载体,构建成靶向ADRB2基因的多重sgRNA表达载体。瞬时转染HEK-293T细胞后,经T7EN I酶切和TA克隆测序明确其对ADRB2基因的修饰效率及方式。通过电穿孔技术将多重sgRNA质粒与Cas9质粒导入人原代T细胞。运用流式细胞术(FCM)检测该方法对靶蛋白β2肾上腺素能受体(β2 adrenergic receptor,β2-AR)的敲除效率。结果:T7EN I酶切和TA克隆测序分析的结果均表明,与单一sgRNA相比,多重sgRNA策略可获得更丰富的突变类型和更高的基因编辑效率。突变模式除了碱基的缺失、插入,还有大片段DNA缺失、倒位。随机送检的10个TA克隆全部发生了基因修饰,突变效率高达100%,且均出现了提前终止密码子。FCM检测发现,对照组中β2-AR阳性T细胞比例为43.09%,但转染多重sgRNA/Cas9后β2-AR的阳性表达率下降至25.61%。结论:本研究初步建立了在人原代T细胞中敲除β2-AR的技术方法,且该方法简便、可操作性强。本研究为进一步深入探索β2-AR在人T细胞抗肿瘤免疫中的作用奠定了技术基础。

磺胺嘧啶银防治老年乳腺癌放射性皮肤损伤的效果

目的观察磺胺嘧啶银防治老年乳腺癌根治术患者放疗过程中放射性皮炎的临床效果。方法收集既往收治的48例乳腺癌根治术后存在放疗指征的老年患者资料,随机分为对照组和研究组,每组24例,分别在开始放疗时给予涂抹三乙醇胺乳膏和磺胺嘧啶银,评估至结束放疗后1个月。观察两组患者皮肤反应程度、疼痛评分和治疗效果之间有无差异,采用MMSA-8用药依从性问卷比较两组患者的依从性。结果两组均发生急性放射性皮肤损伤,对照组1、2级放射性皮炎分别为15例(62.5%)、9例(37.5%),观察组1、2级放射性皮炎分别为17例(70.8%)、7例(29.2%),均可减轻放射性皮炎的严重程度,无严重不良反应发生。两组在放射性皮肤损伤程度、疼痛评分之间的差异无统计学意义(P>0.05)。研究组用药依从性高于对照组,差异有统计学意义,P<0.05。结论磺胺嘧啶银能较好的防治放疗引起的急性放射性皮炎,且费用较低、患者依从性高。

一种改进的非酶处理分离新鲜肾癌组织中浸润淋巴细胞的方法

目的建立一种快速简便的不经过消化酶处理而直接分离、纯化新鲜肾癌组织浸润淋巴细胞的新方法。方法手术切除的新鲜肾癌组织经过机械剪碎、温和匀浆处理制备成单细胞悬液，再通过Ficoll密度梯度离心分离肿瘤浸润淋巴细胞，密度梯度分离后经CD3磁珠分选纯化。结果成功建立了快速从新鲜肾癌组织分离肿瘤浸润淋巴细胞的新方法，成功完成7例组织分离。分析结果显示CD3^＋T细胞占（24．10±17．60）％，CD4^＋和CD8^＋细胞分别占（37．69±9．83）％、（37．86±10．47）％；进一步经磁珠纯化后CD3^＋T细胞纯度达91．6％，适用于后续分析。结论本法优势在于：①与酶消化法相比，有利于保护细胞膜表面受体，最大程度全面反映肿瘤组织中淋巴细胞亚群的浸润情况；②短暂、快速、温和匀浆处理，操作时间短，有利于维持细胞的高活力。

lncRNA SH3PXD2A-AS1对结直肠癌细胞增殖和血管形成能力的影响

目的探讨慢病毒稳转过表达长链非编码RNA(longnon-coding RNA,lncRNA)SH3PXD2A-AS1对人结直肠癌细胞株(HCT116、HT-29)细胞增殖和血管形成能力的影响。方法分别通过lncRNA SH3PXD2A-AS1过表达慢病毒、阴性对照慢病毒转入结直肠癌细胞株HT-29和HCT116;应用qRT-PCR试验检测转染lncRNA SH3PXD2A-AS1慢病毒后lncRNA SH3PXD2A-AS1的mRNA的表达量;Western blot实验检测缺氧诱导因子-1α(hypoxia inducible factor-1α,HIF-1α)蛋白表达量,细胞增殖实验检测过表达lncRNA SH3PXD2A-AS1后对结直肠癌细胞HCT116和HT-29增殖能力的影响;血管形成实验检测过表达lncRNA SH3PXD2A-AS1后对结直肠癌细胞HCT116和HT-29血管形成能力的影响。结果成功构建过表达lncRNA SH3PXD2A-AS1的结直肠癌稳转细胞株,转染lncRNA SH3PXD2A-AS1过表达慢病毒的结直肠癌细胞HCT116和HT-29中lncRNA SH3PXD2A-AS1的表达上调,并且随着其表达上调,HIF-1α的蛋白表达量及该结直肠癌细胞的血管形成能力和增殖能力也上升。结论过表达lncRNA SH3PXD2A-AS1可以促进HIF-1α的表达,通过上调HIF1α从而促进结直肠癌HCT116和HT-29细胞的增殖和血管形成能力。

乳腺癌中FBX022基因通过HIF-1α对血管形成的影响

目的探讨FBXO22基因在乳腺癌血管形成中的作用及分子生物学机制。方法使用FBXO22-siRNA转染人乳腺癌MDA—MB-231和BT-549细胞，体外血管形成实验观察2种乳腺癌细胞中干扰FBXO22后使人脐静脉内皮细胞（human umbilical vein endothelial cells, HUVECs）血管形成数量的变化；Western blot检测FBXO22-siRNA对2种乳腺癌细胞中FBX022、缺氧诱导因子-1α（hypoxia inducible factor-1，HIF—1α）、血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）蛋白表达的影响；Real time—PCR检测干扰FBXO22对2种乳腺癌细胞中HIF-1α和VEGF的mRNA水平的影响。结果在MDA—MB-231和BT-549细胞中干扰FBXO22后分为FBXO22-Ctrl组和FBXO22-si组。与FBX022-Ctrl组相比，MDA—MB-231和BT-549细胞FBX022-si组血管形成数目分别增加了107．1％和181．8％；FBXO22蛋白表达量分别减少了55．5％和51．9％；HIF-1α蛋白表达量分别上升了39．3％和68．4％；VEGF蛋白表达量分别上升了40．7％和21．7％；HIF-1α和VEGF的mRNA水平无明显变化。结论在乳腺癌中FBX022作为抑癌基因对血管形成发挥着重要作用，干扰FBX022后能够通过HIF-1α通路导致VEGF蛋白表达量提高并促进血管形成。

FBXO22基因对乳腺癌细胞迁移侵袭能力的影响及相关机制

目的探讨FBXO22(F-box only protein 22)基因对乳腺癌细胞迁移侵袭能力的影响及相关分子机制。方法使用FBXO22-CtrlRNA(si-Ctrl组)和FBXO22-小干扰RNA(siRNA)(si-FBXO22组)瞬H寸转染人孚L腺癌细胞株MDA-MB-231和BT-549,通过免疫印迹验证FBXO22蛋白水平干扰效果。用Transwell实验分析干扰FBXO22基因后乳腺癌细胞株迁移侵袭能力的变化。免疫印迹检测上皮-间充质转化(EMT)相关蛋白及EMT转录调控因子ZEB1(zinc finger E-box binding homeobox1)的蛋白表达变化。结果在人乳腺癌细胞株MDA-MB-231和BT-549中干扰FBXO22基因后,与si-Ctrl组相比,si-FBXO22组MDA-MB-231和BT-549细胞迁移和侵袭细胞数均明显增加(P<0.01),上皮钙黏素、β-连环蛋白表达明显降低,而纤连蛋白、神经钙黏素和波形蛋白表达明显升高;EMT转录调控因子ZEB1的蛋白表达量明显上升。结论在乳腺癌细胞株中低表达FBXO22基因促进乳腺癌细胞迁移侵袭,其机制可能是通过上调ZEB1进而改变EMT进程而实现。