PSD-95及其突变体的重组腺病毒对皮质神经元的感染

目的构建PSD-95（postsynaptic density-95）及其突变体PSD-95Y523F和PSD-95Y533F（523和533位酪氨酸分别突变成苯丙氨酸）的复制缺陷型重组腺病毒载体，并检测腺病毒颗粒对体外原代培养皮质神经元的感染能力。方法双酶切将PSD-95及其突变体的基因分别从载体peDNA3．1（＋）亚克隆至穿梭载体pAdTrack—CMV中；电穿孔法将穿梭重组体转化到电转感受态细胞BJ5183中，使其与腺病毒骨架载体pAdEasy-1同源重组；同源重组体经PacI酶切线性化，脂质体法转入HEK293H细胞中进行病毒包装；病毒颗粒分别感染HEK293T细胞和原代皮质神经元，荧光检测或免疫印迹方法检测目的蛋白的表达水平。结果经酶切电泳鉴定和序列测定证明同源重组体中含序列正确的目的基因；重组腺病毒颗粒感染HEK293T细胞后，免疫印迹显示有较高水平的目的蛋白表达；重组腺病毒具有感染原代皮质神经元的能力，在未成熟神经元（体外培养5—9天）中感染率低，而在成熟神经元（体外培养13天）中感染率较高。结论成功构建了PSD-95、PSD-95Y523F、PSD-95Y533F的重组腺病毒载体；获得具有感染能力的重组腺病毒颗粒，易于感染成熟的神经元。

TAT—GluR6—9C与pMON原核表达载体重组体的构建

目的表达和纯化TAT—GluR6—9C小肽，用于脑缺血细胞信号转导的研究。方法用化学合成的方法获得TAT—GluR6—9C小肽的cDNA；与原核表达载体pMON用T4DNA连接酶连接；连接产物转化大肠杆菌JMl09进行筛选、序列测定。结果①经化学合成并退火得到了TAT—GluR6—9C的双链cDNA；②酶切鉴定能观察到TAT—GluR6—9C和pMON两条带；③TAT—GluR6—9C测序图谱与GenBank报道完全一致。结论获得了含目的基因TAT—GluR6—9C的pMON原核表达载体重组体。

钙离子通道在缺氧缺糖/再灌注诱导培养皮质神经元损伤中的作用

目的 探讨钙离子通道在缺氧缺糖/再灌注诱导皮质神经元损伤中的作用.方法 采用培养的大鼠皮质神经元缺氧缺糖模型,应用DAPI染色方法,以细胞凋亡率为指标,观察缺氧缺糖诱导神经兀损伤及Ca2＋螯合剂EGTA、NMDA受体拮抗剂MK-801、L-型电压门控钙通道（L-VGCC）拮抗剂尼莫地平、蛋白酪氨酸激酶（PTK）抑制剂染料木黄酮、CaMKⅡ抑制剂NK-62对缺氧缺糖/再灌注诱导神经元损伤的作用.结果 缺氧缺糖/再灌注诱导细胞发生凋亡,至再灌注24 h凋亡率达到80%左右;加入EGTA、MK-801及尼莫地平可以抑制细胞凋亡,凋亡率从80%分别降低为33%、35%和38%;加入染料木黄酮和KN-62可以使凋亡率从80%分别降低为43%和42%.结论 减少胞外Ca2＋浓度、阻断NMDA受体和L-VGCC、抑制蛋白酪氨酸激酶和CaMKⅡ可以减少缺氧缺糖/再灌注诱导的神经元损伤.缺氧缺糖/再灌注诱导的神经元损伤可能与胞外ca2＋内流有关,并与NMDA受体和L-VGCC两类钙通道的开放有关.

大鼠皮质神经元缺氧缺糖/再灌注诱导NMDA受体亚基NR2A酪氨酸磷酸化

目的 研究大鼠皮质神经元缺氧缺糖（OGD）/再灌注诱导N-甲基-D-天冬氨酸（NMDA）受体NR2A酪氨酸磷酸化水平升高的可能分子机制.方法 以培养的大鼠皮质神经元OGD为模型,通过免疫沉淀（IP）及免疫印迹（IB）的方法 研究NR2A酪氨酸磷酸化.结果 OGD/再灌注后NR2A酪氨酸磷酸化水平快速并持续升高,至18 h达高峰（约为sham组的4.9倍）;于OGD前加入乙二醇二乙醚二胺四乙酸（EGTA）、地（艹卓）西平（MK-801）、尼莫地平（nimodipine）、染料木黄酮（genistein）和KN-62等,对NR2A酪氨酸磷酸化的升高均有明显的抑制作用.结论 OGD/再灌注诱导NR2A酪氨酸磷酸化水平的升高可能与胞外Ca2＋内流有关,并与NMDA受体通道和L-型电压门控钙通道（L-VGCC）的开放有关;而且,NMDA受体通道可以进行自身调控,L-VGCC对NMDA受体也有一定的调控作用.

野生型MLK3真核表达载体的构建及其表达

目的构建野生型MLK3真核表达质粒并转染至COS-7细胞中表达。方法以大鼠海马总RNA为模板,通过RT-PCR分段扩增MLK3的序列,采用酶切、链接的方法先将目的基因克隆至pGEM-T,筛选正确的质粒后,再亚克隆至pcDNA3.1(+)。以脂质体转染法将构建好的重组质粒转染至COS-7细胞,通过免疫印迹鉴定重组质粒的表达。结果限制性内切酶酶切和测序结果表明,扩增出的野生型MLK3的序列正确。免疫印迹显示,转染的重组质粒在相对分子质量92×103处有相应条带出现。结论成功构建了MLK3的真核表达质粒,重组质粒在COS-7细胞中高效表达。

大鼠星形胶质细胞培养方法的改进

目的 改进星形胶质细胞的体外纯化培养方法,为研究星形胶质细胞的生物学功能提供实验模型.方法 采用新生 SD大鼠,无菌操作取其大脑皮质,用0.025%的胰酶吹打消化成单个细胞,替代传统的0.25%的胰酶水浴消化15 min,单个细胞悬液接种于预先包被好PDL的24孔板或25 cm2的细胞培养瓶中,体外培养9~14天至细胞完全融合并铺满瓶底后进行传代.第2代细胞应用抗GFAP的抗体进行免疫荧光染色来鉴定星形胶质细胞的纯度.结果 免疫荧光染色结果显示这种培养方法分离培养出的星形胶质细胞纯度达到90%以上.结论 采用本实验改进的方法,培养的大鼠星形胶质细胞纯度高、生长状态良好,符合体外研究要求.

重组穿梭质粒pAdTrack-CMV-Akt1构建及鉴定

目的:构建大鼠Akt1-p Ad Track-CMV腺病毒穿梭质粒并鉴定其蛋白表达。方法:提取SD大鼠海马总RNA,利用RT-PCR方法扩增大鼠Akt1的c DNAs,将其亚克隆入T载体,双酶切鉴定后将其与经过同样处理的腺病毒穿梭质粒载体p Ad Track-CMV连接,经酶切和测序进行鉴定。将p Ad TrackCMV-Akt1转染293细胞,免疫印迹鉴定Akt1的表达。结果:成功克隆出Akt1目的基因,并将其亚克隆入腺病毒穿梭载体p Ad Track-CMV。免疫印迹结果显示,转染p Ad Track-CMV-Akt1的细胞中能检测出Akt1的特异性条带。结论:成功构建重组大鼠Akt1腺病毒穿梭质粒,且其在真核细胞中能高效表达。

GST-pull down方法鉴定Src激酶与PSD-95的直接结合

脚手架蛋白PSD-95通过募集多种蛋白质在包括缺血性脑中风在内的多种神经系统疾病中具有重要的作用。Src蛋白激酶家族是膜相关非受体酪氨酸蛋白激酶中最大的家族,该家族激酶含有与突触后致密蛋白PSD-95相结合的结构域。Src激酶是其家族中主要成员之一,在脑组织中表达丰富。脑缺血/再灌注引起缺血敏感区Src激酶活性的显著增强。之前的研究表明,Src激酶参与调节PSD-95酪氨酸磷酸化。本实验主要通过GST-pull down实验体外鉴定Src与PSD-95之间的直接结合。