条带杂交mRNA定量分析及其在血栓调节蛋白基因表达研究中的应用

含血栓调节蛋白cDNA的质粒转染大肠杆菌,经扩增、酶切、凝胶电泳纯化,获得长度为3.7kb的血栓调节蛋白cDNA,后者用随机引物法标记^(32)P,制成血栓调节蛋白的基因探针。将该探针与血栓调节蛋白mRNA进行条带杂交后,分别用β-液闪仪和放射自显影及密度扫描仪作定量分析。用本法研究了血管内皮细胞中血栓调节蛋白基因表达及血小板血栓调节蛋白mRNA的含量。

噻氯匹啶、阿斯匹林与腹蛇抗栓酶对脑血栓病人血小板聚集的影响及其临床意义

用噻氯匹啶、阿斯匹林与腹蛇抗栓酶治疗25例急性脑血栓病人,这3种药物对肾上腺素引起的血小板聚集的影响和临床疗效中,噻氯匹啶和腹蛇抗栓酶比阿斯匹林显著。

噻氯匹啶对脑血栓病人的血栓烷B_2的抑制

应用噻氯匹啶250mg/d 治疗急性脑血栓15例,疗程3个月。结果,血浆中血栓烷B_2浓度于治疗2周后开始持续性降低,对于ADP 诱导的血小板血栓烷B_2生成量,也有显著的抑制作用,提示噻氯匹啶的抗血栓作用与抑制血小板花生四烯酸代谢有关。

抗纤维蛋白单克隆抗体的制备和鉴定

用XL-FN颗粒、D-D、FN单体等作为免疫原获得一组小鼠单克隆抗体。除了3个与FG有交叉反应,其余均只与XL-FN和/或其片段反应。其中SZ-58、SZ-60及SZ-63与血浆凝块的结合反应不受血浆或全血影响。在免疫印迹电泳中,SZ-63主要识别D-D,而SZ-58不识别任何区带。SZ-58、SZ-60可抑制血浆凝固,并对ADP诱导的血小板聚集有程度不同的抑制作用。SZ-60可与固相化的FG结合而与溶解态的FG无结合反应。结果提示,SZ-58、SZ-60、SZ-63对XL-FN反应的特异性较高,因此可应用于体内血栓显像而SZ-63同时又可应用于D-D检测。

白细胞-内皮细胞的体外粘附反应及眼镜蛇毒的影响

F-MLP与白三烯B_4能增加中性多形核白细胞(PMNL)对人脐静脉内皮细胞的粘附率。白三烯B_4处理的PMNL刺激内皮细胞产生6-酮-PGF_1a,F-MLP或自三烯B_4处理的PMNL促进内皮细胞释放von Willebrand因子。眼镜蛇毒抑制F-MLP或白三烯B_4对PMNL粘附的刺激作用,但这种PMNL仍能促进内皮细胞的花生四烯酸代谢与von Willebrand因子释放。而用F-MLP、白三烯B_4和/或眼镜蛇毒预先处理内皮细胞,不影响白细胞的粘附,也不影响内皮细胞释放6-酮-PGF_1a与von Willebrand因子。这些体外试验结果表明,F-MLP与白三烯B_4在刺激PMNL-内皮细胞粘附中主要的靶细胞是PMNL而不是内皮细胞。PMNL在没有粘附于内皮细胞的情况下也可能通过释放某些介质影响内皮细胞的功能。

血小板第4因子抑制巨核细胞系膜结合型c-kit的表达(英文)

细胞表面受体c-kit与干细胞因子(SCF)对维持血细胞的生成起重要作用。血小板第4因子(PF4)能特异性地抑制巨核细胞生成。在本实验中研究了PF4对两个巨核细胞系HEL和Dami的c-kit表达影响。结果显示,经PF4处理的两株细胞,其c-kit mRNA表达量均下降,细胞表面受体数量降低,SCF与c-kit的结合量亦下降,两组差异有显著意义。在对细胞膜CD34表达影响方面,PF4与TGFβ1的作用相反,PF4促进CD34的表达,而TGFβ1抑制CD34的表达。研究表明,PF4抑制巨核细胞生长的机理,部分途径可能是通过抑制c-kit/SCF而产生。

抗人纤维蛋白单克隆抗体SZ－63可变区基因的克隆及其基因工程抗体的研究

应用氯化铯－超离心法从抗人纤维蛋白单克隆抗体ＳＺ一６３杂交瘤细胞抽取总ＲＮＡ，经Ｏｌｉｇｏ（ｄＴ）纤维素柱层析分离出ｍＲＮＡ。采用ＲＴ－ＰＣＲ技术，扩增出了ＳＺ－６３重链和轻链可变区基因。应用基因重组技术将ＳＺ－６３可变区基因片段与人免疫球蛋白γ１重链ＣＨ１和轻链恒区基因进行拼接，构建噬菌体ＳＺ－６３／ＨｕＦａｂ表达载体，并在大肠杆菌中表达。表达的嵌合抗体Ｆａｂ片段为可溶性，ＥＬＩＳＡ及Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ检测证实能特异地与人纤维蛋白呈结合反应，表达量约为２１０μｇ／Ｌ。

一种快速分离真核细胞RNA的方法

以改良的异硫氰酸胍-苯酚-氯仿法从真核细胞中制备RNA,经琼脂糖微电泳检查,可清楚见到三条真核细胞核糖体RNA带(28S,18S,和5S);经Norther blot检测可见未降解的1.9Kb肌动蛋白mRNA杂交区带。该法具有快速、简便、产率和纯度均较高等优点。

某些疾病状态下血小板表面活化标志蛋白含量的改变

血小板在多种疾病中要发生活化反应并参与血栓形成,本研究利用自制的血小板表面α颗粒膜蛋白(GMP-140)分子数单位点免疫放射分析测定药盒,来研究血栓性疾病等体内血小板的活化程度。结果为:急性心肌梗塞患者体内血小板活化程度显著升高,且与病程相关,以梗塞后48h内为高峰;不稳定型心绞痛、慢性肝炎和肝硬变伴有显著的血小板活化,而稳定型心绞痛、糖尿病及原发性血小板减少性紫癜时,体内血小板活化不明显;血液透析3h血小板活化达高峰,血透结束后24h内恢复至血透前水平。这将为研究疾病状态下血小板的病生改变及血栓性疾病的体外诊断提供依据。

血小板免疫学的进展

血小板免疫学近年来日益受到重视并取得了一些重大进展,在生物大分子即蛋白质和基因水平进行了深入研究。国内学者在该领域中也获得可喜进步。

GPⅡb缺陷基因在血小板无力症家系中的遗传追踪研究

血小板无力症是一种常染色体隐性遗传性出血性疾病,在一非近亲婚配血小板无力症家系中,通过TaqⅠ/GPⅢa基因限制性片段长度多态性(RFLP)连锁分析,未能对家系各成员进行携带者诊断。DNA印迹杂交发现先证者存在一TaqⅠ酶切的2.3kb GPⅡb基因异常片段,应用该异常片段作为特异病理遗传标记,代替传统RFLP分析,在该家系中进行杂合子检测。DNA印迹法与聚合酶链式反应(PCR)分析表明:TaqⅠ异常基因片段来自母方;临床表现正常的的同胞妹妹亦有此缺陷基因,但GPⅡb/Ⅲa表现型正常,故诊断为无力症携带者。然而父亲携带另一尚未发现的有缺陷的GPⅡb等位基因,推测患者为带有两种不同的缺陷基因的双重杂合子。

HLA－DPB_1等位基因与特发性血小板减少性紫癜的相关性研究

采用多聚酶链反应（ＰＣＲ）结合限制性片段长度多态性（ＲＦＬＰ）技术对５３例正常人和５５例慢性特发性血小板减少性紫癜（ＩＴＰ）患者进行ＨＬＡ－ＤＰＢ＿１等位基因分型。结果显示，对照组无一例有ＤＰＢ＿１１３０１等位基因，ＩＴＰ组６例存在ＤＰＢ＿１１３０１等位基因（ＲＲ＝１４．０２，Ｐ＜０．０５），此外，ＤＰＢ＿１０２０１＋０２０２所对应的ＤＰ＿（ｗ２）抗原纯合子在ＩＴＰ组明显多于对照组（ＲＲ＝３．９４，Ｐ＜０．０１），而ＤＰ＿（ｗ２）杂合子明显少于对照组（Ｐ＜０．０２５），提示ＤＰＢ＿１１３０１等位基因及ＤＰ＿（ｗ２）抗原纯合子可能与ＩＴＰ的易感性有关，而ＤＰ＿（ｗ２）抗原杂合子可能具有保护作用。

抗人活化血小板表面α-颗粒膜蛋白GMP-140单克隆抗体SZ-51的研制应用(摘要)

血栓性疾病如急性心肌梗塞、脑血栓形成是危害人类健康的主要疾病,对它的早期特异性诊断和治疗是降低病死率的关键。活化血小板是血栓的主要组份之一,在血栓形成的病理生理中起重要的作用。它和血循环中的静止血小板相比,表面暴露着许多新出现的特异性抗原,成为血小板活化或血栓形成的特异性标记。因此,抗人活化血小板单克隆抗体(单抗)可作为血栓检测、诊断和治疗的有效工具。本研究包括国内第一株抗人活化血小板表面α—颗粒膜蛋白(GMP-140)单抗SZ-51的制备,以及应用这株单抗所建立的血小板活化程度检测方法和对多种病理状态下血小板体内活化程度进行的研究。SZ-51单抗的杂交瘤细胞株由本室改良的Kohler和Milstein法融合产生。单抗SZ-51识别的抗原位于静止血小板内α—颗粒膜上。

风湿性心脏病中血小板活化状态的研究

作者研究了风心病患者血小板膜表面活化标记蛋白(GMP-140)及血小板代谢、释放产物的变化。结果表明:风心病患者血小板膜表面及血浆 GMP-140分子数均明显升高,血浆β-TG、TXB_2也增高,窦律组风心病患者的血小板活化程度低于房颤组及血栓栓塞组风心病患者。结果表明风心病患者伴有较明显的血小板活化,这对进一步研究血小板在风心病血栓栓塞中的作用有重要意义。

变性梯度凝胶电泳检测轻型血友病甲的基因突变(Arg1689Cys)

血友病甲是一种常见的遗传性出血性疾病,由因子FⅧ缺乏引起。应用聚合酶链反应和变性梯度凝胶电泳技术,在一例轻型血友病甲患者的因子Ⅷ基因第14号外显子3’端发现碱基替换;直接测序表明密码子CGC突变为TGC,导致FⅧ蛋白Arg1689Cys,使凝血活化FⅧ发生障碍。该突变同时产生一个PstⅠ限制性酶切位点,该突变已证实与血友病相关。

电脑分析基因碱基序列

采用APPLE—Ⅱ微机和APPLESOFT BASIC资料档编写了DNA序列分析程序。该程序能迅速有效地存贮基因的碱基序列,并能检索200核苷酸(nt)以内的DNA 序列在基因中出现的位置与次数。通过各种附加程序,该程序能衍生出限制酶谱制作、基因结构分析、蛋白质序列估算及PCR 引物设计等多种功能。该程序在血栓与止血的分子生物学及其它医学生物学领域中有着广泛的应用。

Effects of tanshinone Ⅱ-A sullfonate on adhesion molecule expression of endothelial cells and platelets in vitro

探讨丹参酮ⅡＡ磺酸钠（Ｔａｎ）对培养人脐静脉内皮细胞（ＨＵＶＥＣ）和人血小板表达粘附分子的影响．方法：用流动血细胞计数仪测定肿瘤坏死因子（ＴＮＦα）诱导人脐静脉内皮细胞ＩＣＡＭ１和凝血酶诱导人血小板Ｐ选择素的表达．结果：ＨＵＶＥＣ经ＴＮＦα处理后，明显增加细胞表面ＩＣＡＭ１的表达，增加ＨＬ６０细胞粘附到内皮细胞表面达加入细胞总数的３０％±６％（对照组为４６％±０７％）．在ＴＮＦα处理前，用Ｔａｎ（２５－２００μｍｏｌ·Ｌ－１）与ＨＵＶＥＣ共孵育，则Ｔａｎ剂量依赖性地抑制ＴＮＦα的作用．Ｔａｎ（２５－２００μｍｏｌ·Ｌ－１）与人血小板孵育后，可剂量依赖性地抑制凝血酶诱导人血小板表面Ｐｓｅｌｅｃｔｉｎ的表达．结论：Ｔａｎ可抑制内皮细胞和血小板表达粘附分子．

中国人von Willebrand因子基因RFLPs分析

von Willebrand因子(vWF)是一个血浆大分子粘附糖蛋白,在血小板粘附于受损血管壁过程中起重要作用。另外,vWF还作为血浆凝血因子Ⅷ(FⅧ)的载体,防止FⅧ活性降解.vWF基因定位于12 p12—pter,全长约178kb,包含52个外显子。vWF mRNA编码一条由2813氨基酸组成的多肽,其中包含一个信号肽。

抗人活化血小板单克隆抗体SZ－51嵌合Fab片段在大肠杆菌中的表达

单克隆抗体介导的导向显像与导向溶栓是对血栓栓塞性疾病诊断与治疗的有效手段之一。为了降低鼠源性单抗对人体的免疫原性，我们应用基因重组技术将抗人活化血小板α颗粒膜蛋白ＧＭＰ－１４０单克隆抗体ＳＺ－５１可变区基因片段与人免疫球蛋白γ１重链ＣＨ１和轻链恒区基因进行拼接，构建噬菌体质粒（ｐＨＥＮ１－５１Ｆａｂ／Ｈｕ），并导入大肠杆菌ＨＢ２１５１中进行表达。表达的嵌合抗体Ｆａｂ片段为可溶性，经Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ证实能特异地与ＧＭＰ－１４０呈结合反应。经ＥＬＩＳＡ定量测定，表达上清液中的抗体含量为２００μｇ／Ｌ。

造血生长因子对小鼠骨髓巨核细胞集落形成的影响

造血生长因子对小鼠骨髓巨核细胞集落形成的影响万海英，韩忠朝，阮长耿自从７０年代中期Ｍｅｌｃａｌｆ等报道巨核系祖细胞集落形成单位（ＣＦＵ－ＭＫ）的体外培养获得成功以来￣［１］，人们利用各种方法研究巨核细胞的生成、分化与调控。目前被认为对巨核细胞生长有促...