小檗碱介导BMAL1:CLOCK复合体调控糖脂代谢改善脂肪胰岛素抵抗的效应机制

探究小檗碱介导脑和肌肉芳香烃受体核转位样蛋白1(brain and muscle arnt-like 1,BMAL1):昼夜自发输出周期蛋白kaput(circadian locomotor output cycles kaput,CLOCK)复合体,调控糖脂代谢改善脂肪胰岛素抵抗(insulin resistance,IR)的作用机制。地塞米松诱导96 h建立IR-3T3-L1脂肪细胞模型,0.5、1、5、10、20μmol·L^(-1)小檗碱给药24 h。葡萄糖氧化酶法和细胞活性(cell counting kit-8,CCK-8)试剂盒分别检测胞外葡萄糖含量和细胞活力;酶比色法检测甘油三酯(triglyceride,TG)和甘油含量;油红O染色检测脂滴;荧光染色检测Ca2+、线粒体结构及活性氧(reactive oxygen species,ROS);蛋白免疫印迹(Western blot,WB)检测脂联素(adiponectin,ADPN)、BMAL1、CLOCK、激素敏感性脂肪酶(hormone-sensitive triglyceride lipase,HSL)、碳水化合物反应元件结合蛋白(carbohydrate-responsive element-binding protein,ChREBP)、固醇调节元件结合蛋白1C(sterol regulatory element-binding protein 1C,SREBP-1C)、过氧化物酶体增殖物激活受体γ共激活剂1α(peroxisome proliferator activated receptorγcoactivator 1α,PGC1α)、肉碱棕榈酰基转移酶1α(choline phosphotransferase 1α,CPT1α)、过氧化物酶体增殖物激活受体α(peroxisome proliferators-activated receptorsα,PPARα),免疫荧光检测BMAL1核定位。此外,添加20μmol·L^(-1)CLK8(CLOCK抑制剂)检测葡萄糖消耗量及BMAL1/ChREBP/PPARα蛋白。研究结果显示小檗碱增加IR-3T3-L1脂肪细胞葡萄糖消耗量,且不影响细胞活力;小檗碱降低IR-3T3-L1脂肪细胞胞内TG,5μmol·L^(-1)小檗碱升高甘油含量,减少脂滴积累,提示其加强脂解,而10μmol·L^(-1)小檗碱不影响甘油含量且脂滴更少,提示其可能同时加强脂解和甘油利用。此外,小檗碱降低IR-3T3-L1脂肪细胞胞内Ca^(2+)和ROS改善线粒体功能,上调PGC1α有助于维护线粒体结构。结果还显示小檗碱上调ADPN,提示其增加IR-3T3-L1脂肪细胞胰岛素敏感性,上调外周节律调控蛋白BMAL1和CLOCK并增加BMAL1核定位,上调脂解关键蛋白HSL和脂氧化限速酶CPT1α,下调TG合成关键蛋白SREBP-1C,小檗碱同时上调IR-3T3-L1脂肪细胞ChREBP和PPARα,以上结果共同提示其促糖转脂增强降糖效应。鉴于CLK8特异性抑制CLOCK酰基化修饰BMAL1形成复合体,结果显示CLK8添加小檗碱可降低葡萄糖消耗量,提示小檗碱上调BMAL1:CLOCK复合体改善糖代谢。CLK8添加小檗碱组上调BMAL1但下调ChREBP和PPARα,因而推测小檗碱介导BMAL1:CLOCK复合体调控细胞糖脂代谢减轻脂肪细胞IR。

葛根芩连汤促进糖尿病大鼠棕色脂肪分化改善糖脂紊乱的分子机制

研究葛根芩连汤(GQD)对糖尿病大鼠棕色脂肪组织(BAT)分化及能量代谢的影响。给药干预高脂喂养加小剂量链脲佐菌素(STZ)诱导糖尿病大鼠13周,在确认降糖药效基础上,提取大鼠肩胛骨周围BAT总RNA,qPCR法检测核转录基因Prdm16、Pparγc1α、Pparα、Pparγ和Sirt1,BAT标志基因Ucp1、Cidea、Dio2和能量消耗基因Ampkα2,脂肪分泌因子Adpn、Fndc5、Angptl8、IL-6和Rbp4表达。IPA通路软件分析qPCR数据干预差异。提取BAT总蛋白,Western blot法检测PRDM16、PGC1α、PPARγ、PPARα、SIRT1、ChREBP、AMPKα、UCP1、ADPN、NRG4、GLUT1和GLUT4等表达水平。结果显示,与模型组相比,GQD显著上调糖尿病大鼠Pparγc1α、Pparα、Pparγ、Ucp1、Cidea、Ampkα2、Dio2、Fndc5、Rbp4和Angptl8表达水平(P<0.05),显著下调Adpn和IL-6表达水平(P<0.05),Prdm16表达有上调趋势(P=0.182),而Sirt1表达有下调趋势(P=0.104)。IPA通路功能分析显示GQD促进脂肪组织棕色化,激活PPARα/RXRα和SIRT1信号通路,减少脂质积累。与正常组相比,模型组PRDM16、PGC1α、PPARα、PPARγ、SIRT1、ChREBP、AMPKα、UCP1、GLUT1、GLUT4和NRG4蛋白表达下调(P<0.01),给药后表达上调(P<0.05);与正常组相比,模型组ADPN蛋白表达上调(P<0.01),给药后表达下调(P<0.01)。研究表明GQD促进BAT分化成熟,增加能量消耗,有助于减轻机体糖脂代谢紊乱,改善糖尿病症状。

葛根芩连汤缓解肝内质网应激改善体内外糖代谢的效应机制

探讨葛根芩连汤(Gegen Qinlian Decoction,GQD)缓解内质网应激(endoplasmic reticulum stress,ERS)改善体内外糖代谢的效应机制。分子对接预测GQD入血主要药效成分与ERS相关靶点的结合活性。取冻存正常组、高脂诱导糖尿病模型组、二甲双胍组和GQD组大鼠肝组织,提取RNA和蛋白质,qPCR检测ERS标志蛋白葡萄糖调节蛋白78(glucose-regulated protein 78,Grp78)、未折叠蛋白反应(unfolded protein response,UPR)通路基因肌醇需求酶1(inositol requiring enzyme 1,Ire1)、转化因子6(activating transcription factor 6,Atf6)、Atf4、C/EBP同源蛋白(C/EBP-homologous protein,Chop)和半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶(caspase)-12基因mRNA表达;Western blot检测GRP78、IRE1、蛋白激酶R样内质网激酶(protein kinase R-like ER kinase,PERK)、ATF6、X-盒结合蛋白1(X-box binding protein 1,XBP1)、ATF4、CHOP、caspase-12、caspase-9和caspase-3蛋白表达;比色法检测肝组织钙离子含量。体外采用衣霉素诱导6 h建立ERS-HepG2细胞模型,2.5%、5%、10%GQD含药血清(GQD-containing serum)给药9 h,葡萄糖氧化酶法检测细胞外液葡萄糖含量;流式细胞术检测细胞凋亡;糖原染色检测细胞糖原含量;免疫荧光检测ERS标志蛋白GRP78表达;比色法检测胞内钙离子含量;Western blot检测GRP78和ERS诱导IRE1、PERK、ATF6和真核翻译启动因子2α(eukaryotic translation initiation factor 2α,eIF2α)磷酸化,同时检测胰岛素降糖通路蛋白胰岛素受体底物1(insulin receptor substrate 1,IRS1)、磷脂酰肌醇3-激酶p85调控亚基(phosphatidylinositol 3-kinase regulatory subunit p85,PI3Kp85)和蛋白激酶B(protein kinase B,Akt)的磷酸化水平。此外,Western blot检测沟通ERS与胰岛素降糖通路的c-Jun氨基末端激酶(c-Jun N-terminal kinase,JNKs)磷酸化水平。分子对接结果显示,GRP78、IRE1、PERK、ATF4与黄芩素、小檗碱、大豆黄酮、药根碱、甘草苷、棕榈碱、葛根素、汉黄芩苷有较强结合活性,提示GQD可能干预ERS诱导的UPR。体内结果显示,GQD可下调糖尿病大鼠Ire1、Atf6、Atf4、Grp78、caspase-12、Chop的mRNA转录,下调GRP78、IRE1和PERK及ERS诱导凋亡相关因子ATF4和CHOP、caspase-12、caspase-9和caspase-3表达,上调XBP1增强适应性UPR。此外,GQD可升高肝组织钙离子含量,有助于蛋白正确折叠。体外结果显示,GQD可增加衣霉素诱导ERS-HepG2细胞葡萄糖消耗量且不明显影响细胞活力,增加肝糖原合成,下调ATF6和p-eIF2α(Ser51)、IRE1、PERK和GRP78的表达,下调p-IRS1(Ser312)和p-JNKs(Thr183/Tyr185)的表达,上调p-PI3Kp85(Tyr607)和p-Akt(Ser473)的表达。研究提示GQD可缓解肝过度ERS,减轻胰岛素抵抗,改善体内外肝糖代谢。