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慢病毒介导的CRISPR/Cas9技术编辑PFF细胞BMPR-IB基因及BMPs信号通路重要基因表达分析
被引量:
3
1
作者
杨强
徐盼
+4 位作者
蒋凯
乔传民
任军
黄路生
幸宇云
《中国农业科学》
CAS
CSCD
北大核心
2018年第7期1378-1389,共12页
【目的】利用慢病毒介导的CRISPR/Cas9基因组编辑技术获得编辑BMPR-IB(bone morphogenetic protein receptor,type IB)基因的猪胎儿成纤维细胞(pig fetal fibroblasts,PFF),并研究该基因被编辑后对骨形态发生蛋白(bone morphogenetic pr...
【目的】利用慢病毒介导的CRISPR/Cas9基因组编辑技术获得编辑BMPR-IB(bone morphogenetic protein receptor,type IB)基因的猪胎儿成纤维细胞(pig fetal fibroblasts,PFF),并研究该基因被编辑后对骨形态发生蛋白(bone morphogenetic proteins,BMPs)信号通路中重要功能基因表达的影响。【方法】针对猪的BMPR-IB基因的外显子8,利用在线软件http://crispr.mit.edu获得了21条sg RNAs(single-guide RNAs)序列;得分最高的sg RNA与互补序列(包含接头)退火成双链后连接入线性化的lenti CRISPR v2质粒以获得打靶质粒,打靶质粒与包装质粒ps PAX2和p CMV-VSV-G按5﹕4﹕1质量比混合后通过293T细胞包装慢病毒。慢病毒溶液经0.45μm滤膜回收后与PFF细胞培养液按照1﹕1混合、并加入聚凝胺(polybrene)至终浓度为6μg·m L-1,在1 000 g转速、32℃下离心感染PFF细胞1 h。感染3 d后,细胞在含3.5μg·m L-1嘌呤霉素的培养液中筛选6—7 d,最终获得编辑BMPR-IB基因的PFF细胞克隆群。针对编辑(打靶)细胞,首先通过T7E1酶切检测突变体,初步判断打靶效率,再通过PCR、PCR-TA克隆分析细胞的编辑及脱靶情况。利用RT-PCR检测编辑和对照组细胞中与BMPs信号通路相关的重要基因的表达情况;Western blotting检测编辑细胞与对照组细胞中BMPR-IB基因的蛋白表达量。利用Cell Counting Kit-8(CCK-8)试剂盒检测编辑细胞及对照组细胞的增殖能力。【结果】T7E1酶切及PCR测序均证实PFF细胞成功打靶目标DNA区域;TA克隆测序表明目标区域发生了插入与缺失突变,突变率为70%。针对20个潜在的脱靶位点的TA克隆测序结果表明,仅1个位点出现了10%(2/20)的脱靶情况。RT-PCR结果显示,打靶细胞与对照组细胞相比,BMPR-IB、Cylin D2、Cdk2和Bcl2基因的表达量均极显著下降(P<0.01)。Western blotting结果显示,打靶细胞BMPR-IB基因的表达量较对照组细胞降低62%。CCK-8检测试验表明,同一代细胞中,打靶PFF的增殖能力极显著低于对照组细胞(P<0.01);打靶细胞中,随着传代的(P5、P7和P9)增加其增殖能力极显著下降(P<0.01),而对照组细胞不同代次间细胞增殖能力无显著差异(P>0.05);打靶PFF的增殖能力不受嘌呤霉素筛选的影响。【结论】慢病毒介导的CRISPR/Cas9技术可针对PFF细胞快速高效地实现基因编辑;在BMPR-IB基因编辑细胞中,BMPs通路重要功能基因的表达量显著下降,该基因对PFF细胞的增殖有重要的调节作用。
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关键词
慢病毒
CRISPR/Cas9
猪胎儿成纤维细胞
BMPR-IB
脱靶
细胞增殖
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职称材料
题名
慢病毒介导的CRISPR/Cas9技术编辑PFF细胞BMPR-IB基因及BMPs信号通路重要基因表达分析
被引量:
3
1
作者
杨强
徐盼
蒋凯
乔传民
任军
黄路生
幸宇云
机构
江西农业大学猪遗传改良与养殖技术省部共建国家重点实验室
出处
《中国农业科学》
CAS
CSCD
北大核心
2018年第7期1378-1389,共12页
基金
国家自然科学基金(31560304)
国家科技重大专项(2016ZX08006-003)
文摘
【目的】利用慢病毒介导的CRISPR/Cas9基因组编辑技术获得编辑BMPR-IB(bone morphogenetic protein receptor,type IB)基因的猪胎儿成纤维细胞(pig fetal fibroblasts,PFF),并研究该基因被编辑后对骨形态发生蛋白(bone morphogenetic proteins,BMPs)信号通路中重要功能基因表达的影响。【方法】针对猪的BMPR-IB基因的外显子8,利用在线软件http://crispr.mit.edu获得了21条sg RNAs(single-guide RNAs)序列;得分最高的sg RNA与互补序列(包含接头)退火成双链后连接入线性化的lenti CRISPR v2质粒以获得打靶质粒,打靶质粒与包装质粒ps PAX2和p CMV-VSV-G按5﹕4﹕1质量比混合后通过293T细胞包装慢病毒。慢病毒溶液经0.45μm滤膜回收后与PFF细胞培养液按照1﹕1混合、并加入聚凝胺(polybrene)至终浓度为6μg·m L-1,在1 000 g转速、32℃下离心感染PFF细胞1 h。感染3 d后,细胞在含3.5μg·m L-1嘌呤霉素的培养液中筛选6—7 d,最终获得编辑BMPR-IB基因的PFF细胞克隆群。针对编辑(打靶)细胞,首先通过T7E1酶切检测突变体,初步判断打靶效率,再通过PCR、PCR-TA克隆分析细胞的编辑及脱靶情况。利用RT-PCR检测编辑和对照组细胞中与BMPs信号通路相关的重要基因的表达情况;Western blotting检测编辑细胞与对照组细胞中BMPR-IB基因的蛋白表达量。利用Cell Counting Kit-8(CCK-8)试剂盒检测编辑细胞及对照组细胞的增殖能力。【结果】T7E1酶切及PCR测序均证实PFF细胞成功打靶目标DNA区域;TA克隆测序表明目标区域发生了插入与缺失突变,突变率为70%。针对20个潜在的脱靶位点的TA克隆测序结果表明,仅1个位点出现了10%(2/20)的脱靶情况。RT-PCR结果显示,打靶细胞与对照组细胞相比,BMPR-IB、Cylin D2、Cdk2和Bcl2基因的表达量均极显著下降(P<0.01)。Western blotting结果显示,打靶细胞BMPR-IB基因的表达量较对照组细胞降低62%。CCK-8检测试验表明,同一代细胞中,打靶PFF的增殖能力极显著低于对照组细胞(P<0.01);打靶细胞中,随着传代的(P5、P7和P9)增加其增殖能力极显著下降(P<0.01),而对照组细胞不同代次间细胞增殖能力无显著差异(P>0.05);打靶PFF的增殖能力不受嘌呤霉素筛选的影响。【结论】慢病毒介导的CRISPR/Cas9技术可针对PFF细胞快速高效地实现基因编辑;在BMPR-IB基因编辑细胞中,BMPs通路重要功能基因的表达量显著下降,该基因对PFF细胞的增殖有重要的调节作用。
关键词
慢病毒
CRISPR/Cas9
猪胎儿成纤维细胞
BMPR-IB
脱靶
细胞增殖
Keywords
Lentivirus
CRISPR/Cas9
porcine fetal fibroblasts
BMPR-IB
off-target
cell proliferation
分类号
Q78 [生物学—分子生物学]
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职称材料
题名
作者
出处
发文年
被引量
操作
1
慢病毒介导的CRISPR/Cas9技术编辑PFF细胞BMPR-IB基因及BMPs信号通路重要基因表达分析
杨强
徐盼
蒋凯
乔传民
任军
黄路生
幸宇云
《中国农业科学》
CAS
CSCD
北大核心
2018
3
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