脐血间充质干细胞与骨髓间充质干细胞对淋巴细胞增殖的抑制效果比较

目的:比较脐血间充质干细胞和骨髓间充质干细胞对植物血凝素诱导的淋巴细胞增殖的抑制作用。方法:实验于2005-07/2006-03在南昌大学第二附属医院血液病研究所及江西省医学分子重点实验室完成。①实验材料:脐带血9份,由南昌大学第二附属医院妇产科提供,产妇及其家属均知情同意。正常骨髓9份,由南昌大学第二附属医院血液科门诊及住院患者提供,均附有捐赠同意书。外周血9份,取自正常自愿者。本实验经医学伦理委员会批准。②实验方法:无菌条件下采集脐血、骨髓和正常人外周血,分离单个核细胞。脐血及骨髓单个核细胞以1×109 L-1接种于培养瓶中,加入含体积分数为0.1的小牛血清、1×10-3mol/L氢化可的松的IMDM培养液,7d后换液,去除悬浮细胞,以后每3～4d换液1次,待细胞90%融合后,胰蛋白酶+乙二胺四乙酸混合消化,传代培养,取第3代细胞用于实验。正常人外周血单个核细胞以1×109 L-1接种于培养瓶中,加入含体积分数为0.1的小牛血清、10mg/L植物血凝素的IMDM液,培养3d后收集细胞用于实验。③实验评估:采用流式细胞术检测脐血间充质干细胞及淋巴细胞表面分子。取第3代的脐血和骨髓间充质干细胞,体外诱导培养后以脂肪染色液鉴定其向脂肪细胞的分化情况。将不同细胞浓度的脐血和骨髓间充质干细胞分别加入到植物血凝素诱导的外周血淋巴细胞增殖体系中,比较两种不同来源的间充质干细胞对淋巴细胞增殖的调控作用。结果:①脐血间充质干细胞和骨髓间充质干细胞的培养及鉴定:第3代脐血间充质干细胞表面分子标记率CD29为85.18%,CD166为72.52%,CD54为33.70%,CD45为6.70%,CD13为1.51%,CD34为0.23%。正常人外周血单个核细胞中的CD3+T细胞为60%～70%,CD20+B细胞为3.5%～4.5%。脐血间充质干细胞诱导培养3周,可见呈桔黄色的脂肪细胞。②脐血间充质干细胞及骨髓间充质干细胞对淋巴细胞增殖的抑制:淋巴细胞:间充质干细胞为1∶1,1∶0.5,1∶0.1,1∶0.05,1∶0.02,1∶0.01时,脐血间充质干细胞对淋巴细胞增殖的抑制率分别为(49.5±4.8)%,(58.4±6.0)%,(38.1±4.0)%,(31.4±3.2)%,(24.3±3.2)%,(12.6±6.7)%,而骨髓间充质干细胞对淋巴细胞增殖的抑制率分别为(52.4±8.4)%,(65.1±9.7)%,(34.7±4.5)%,(13.0±6.4)%,(-10.7±12.6)%,(-43.9±9.4)%。后3种细胞浓度比例脐血间充质干细胞对淋巴细胞的抑制作用明显强于骨髓间充质干细胞(t=7.72,8.14,14.68,P均<0.05)。结论:脐血间充质干细胞与骨髓间充质干细胞一样,也具有抑制植物血凝素诱导淋巴细胞增殖的作用,抑制效果与间充质干细胞数量有关。低浓度的脐血间充质干细胞对淋巴细胞的抑制作用明显强于骨髓间充质干细胞。

骨髓与脐带血间充质干细胞的生物学特性比较

目的:为寻找最佳的间充质干细胞来源,比较脐带血来源间充质干细胞与骨髓来源间充质干细胞在生长、细胞表型及多项分化功能方面的差别。方法:实验于2006-06/2007-03在南昌大学医学院第二附属医院分子实验室、江西省医学分子重点实验室,省级重点实验室完成。①实验材料:脐带血30份及正常骨髓30份均取自正常自愿捐献者,实验经医院伦理委员会批准。②实验方法:无菌条件下采集脐血及骨髓,分离单个核细胞。将脐血及骨髓单个核细胞以1×109L-1接种于培养瓶中,加入含体积分数0.20自体血清、1mmol/L氢化可的松的IMDM培养液,7d后换液,去除悬浮细胞,以后每三四天换液1次,待细胞90%融合后,经胰蛋白酶+乙二胺四乙酸混合消化,传代培养,取第3代细胞,采用流式细胞术鉴定脐带血来源间充质干细胞表面分子,并比较两种不同来源间充质干细胞的生长特点及向脂肪细胞分化能力的差别。结果:①骨髓来源间充质干细胞在较早阶段形态即成长梭形,第3代后与脐带血来源间充质干细胞形态无明显差别。②培养至第3代的间充质干细胞表面分子检测与脐血单个核细胞比较结果显示,CD166、CD29、CD54表达增高,CD13、CD34、CD45表达降低。③脐带血来源间充质干细胞培养的成功率低于骨髓来源间充质干细胞,在较早阶段脐带血来源间充质干细胞增殖快于骨髓来源间充质干细胞,但后期培养过程中脐带血来源间充质干细胞增殖慢于骨髓来源间充质干细胞,两种来源间充质干细胞均能分化为脂肪细胞,且分化能力无明显差别。结论:脐血来源间充质干细胞作为一种新来源的间充质干细胞在生长速度、培养成功率上虽然低于骨髓来源间充质干细胞,但在细胞表型及分化功能方面无明显差别。

国人冠心病发生VT/VF的首个致病基因SCN5A的发现及突变功能分析

目的心源性猝死(SCD)高危患者常见于两大类人群,一类为心脏结构正常的患者,另一类为心脏结构异常的患者。心脏结构异常患者发生SCD以冠心病患者多见,国际上曾报道SCN5A基因突变与心梗后电风暴有关。本研究将对国人冠心病并发恶性室性心律失常患者进行SCN5A基因筛查,以探索是否SCN5A与国人缺血性心律失常相关,并揭示其细胞电生理致病机制。方法临床收集冠心病发生恶性心律失常患DNA标本31份,使用DNA直接测序技术对选基因SCN5A进行筛查,寻找基因突变,使用细胞膜片钳技术进行突变通道功能分析。结果本研究对31例国人冠心病发生VT/VF患者进行已知致病基因SCN5A筛查,发现2个SCN5A基因新突变,即L1469S和R812C突变。通过细胞膜片钳技术,分别对转染R812C突变和L1469S突变的HEK293细胞进行功能分析,观察峰值电流,I-V曲线,电流密度,电流失活等特性。结果与正常对照组相比,发现突变通道明显增加SCN5A峰值电流密度,I-V曲线电流失活没有明显差异。结论首次揭示SCN5A基因是国人冠心病发生恶性心律失常的致病基因,其突变通道功能获得是发生冠心病发生恶性心律失常的细胞电生理机制。

PTEN对子宫内膜癌细胞株迁移和侵袭能力的影响

背景与目的:10号染色体上磷酸酶和张力蛋白同源缺失的基因(phosphatase and tensin homologue deleted on chromosome 10,PTEN)是较为常见的抑癌基因之一。多项研究表明,其在子宫内膜组织中表达量降低,但是对子宫内膜细胞具体的功能及机制却不十分清楚。本研究旨在探讨PTEN对子宫内膜癌HEC-1B细胞迁移及侵袭能力的影响及相关机制,为子宫内膜癌治疗提供新靶点。方法:运用基因重组技术构建pIRES2-ZsGreen1-PTEN重组质粒;将重组质粒转染至子宫内膜癌HEC-1B细胞中,以转染pIRES2-ZsGreen1空载质粒为对照;运用体外划痕、Transwell迁移及侵袭实验分别检测过表达PTEN后细胞迁移和侵袭能力的变化;运用Western blot法检测过表达PTEN后细胞中PTEN、AKT、p-AKT及MMP-2蛋白表达量的变化。结果:PCR产物凝胶电泳显示一条1.2 kb大小的条带,与PTEN cDNA大小符合;基因测序结果与Genbank中PTEN cDNA的序列一致,表明质粒构建成功;转染后48 h荧光显微镜下见荧光且Western blot显示PTEN蛋白表达量增加,表明重组质粒在HEC-1B细胞中表达成功;体外划痕及transwell迁移实验表明,过表达PTEN后HEC-1B细胞的迁移能力减弱;体外侵袭实验显示,过表达PTEN后HEC-1B细胞的侵袭能力明显低于对照组及未处理组;Western blot结果表明,过表达PTEN会降低HEC-1B细胞中p-AKT蛋白表达下降,但是AKT蛋白量却不受影响,同时p-AKT下游的MMP-2蛋白表达量下降。结论:PTEN能明显抑制子宫内膜癌HEC-1B细胞的迁移和侵袭,这一作用可能是通过抑制AKT磷酸化,从而降低MMP-2蛋白的表达而实现的。

过表达钙周期蛋白S100A6对子宫内膜异位症在位内膜间质细胞生物学行为的影响

目的探讨过表达钙周期蛋白S100A6对子宫内膜异位症(EMs)在位子宫内膜间质细胞生物学行为的影响。方法体外培养EMs在位子宫内膜间质细胞,将慢病毒载体和表达S100A6的重组慢病毒Lv-S100A6分别处理在位内膜间质细胞,设对照组,用CCK-8法检测细胞增殖,Transwell观察细胞迁移,流式细胞仪观察细胞凋亡。结果 LvS100A6组细胞的增殖活性明显高于干预组以及对照组(P<0.05)。Lv-S100A6组细胞的迁移数明显高于干预组以及对照组(P<0.05)。Lv-S100A6组细胞凋亡率为2.99%,明显低于对照组的13.48%和干预组的14.40%(P<0.05)。结论通过上调细胞中S100A6的表达水平能增加EMs在位子宫内膜间质细胞的增殖能力,促进细胞的迁移并抑制细胞的凋亡。

子宫内膜癌中PI3K/AKT及JAK/STAT信号通路与IDO介导的免疫逃逸机制研究进展

子宫内膜癌是女性生殖系统中最常见的一种恶性肿瘤,其发生和发展与多条信号通路的异常以及肿瘤相关基因的突变有关。磷脂肌醇3-激酶(phosphoinositide-3kinase,PI3K)-蛋白激酶B(protein kinase B,PKB,又称AKT)信号通路与Janus激酶(janus kinase,JAK)/信号转导及转录激活因子(signal transducer andactivator of transcription,STAT)信号通路是近几年来与子宫内膜癌发生相关信号通路研究的热点;大量的研究发现,它们的调节异常与子宫内膜的发生、发展、预后以及复发密切相关。除了肿瘤相关基因异常外,有研究认为肿瘤的发生不仅是异常细胞以及恶性克隆的产生,还与肿瘤的免疫逃逸(tumor immune escape)有关,其可使机体不能及时的清除异常组织,从而介导了肿瘤的发生、侵袭与转移。有研究发现,在肿瘤免疫逃逸过程中发挥重要作用的吲哚胺2,3双加氧酶(indoleamine2,3-dioxygenase,IDO)与上述两条通路存在密切的关联,这可能正是肿瘤组织在机体中不仅能够稳定繁殖,还不易被机体免疫系统清除的关键所在。因此,本文旨在就上述两条信号通路与IDO相关性的研究作一综述。

靶向STAT3基因的小干扰RNA对子宫内膜癌HEC-1B细胞生物学行为的影响

目的 :探讨靶向信号转导与转录激活因子3(signal transducer and activator of transcription 3,STAT 3)基因的小干扰RNA(small interfering RNA,siRNA)对人子宫内膜癌HEC-1B细胞生物学行为的影响。方法 :将化学合成的靶向STAT 3基因的siRNA片段(si-STAT3)转染至HEC-1B细胞,实时荧光定量-PCR法检测转染后细胞中STAT3 mRNA的表达,CCK-8(cell counting kit-8)法检测细胞的增殖活性,FCM法检测细胞周期和细胞凋亡,Transwell小室法检测细胞的迁移和侵袭,蛋白质印迹法检测细胞中STAT3、磷酸化STAT3及其下游细胞周期蛋白D2(cyclin D2,CCND2)和基质金属蛋白酶2(metalloproteinase-2,MMP-2)蛋白的表达。结果 :与空白对照组(HEC-1B细胞中仅加入脂质体)或转染对照干扰片段(si-control)组比较,转染si-STAT3后的HEC-1B细胞中STAT3 mRNA的表达水平明显降低(P<0.01),细胞的增殖活性明显下降(P<0.01),G1期细胞所占比例上升,S期细胞所占比例下降(P<0.01),细胞早期凋亡率明显升高(P<0.01),细胞的迁移和侵袭能力明显下降(P<0.01),HEC-1B细胞中STAT3、磷酸化STAT3及其下游CCND2和MMP-2蛋白的表达水平明显下调(P<0.01)。结论 :靶向STAT 3基因的特异性si-RNA片段能够下调HEC-1B细胞中STAT3mRNA及其蛋白的表达,抑制HEC-1B细胞的增殖、侵袭和迁移,并诱导其凋亡。

米非司酮联合三氧化二砷对K562/ADM的逆转作用及其机制

目的:探讨米非司酮(mifepristone)联合三氧化二砷(As2O3)对K562/ADM的逆转作用及机制研究。方法:不同浓度米非司酮、As2O3处理细胞72h,采用MTT法检测细胞增殖活性;流式细胞仪检测细胞凋亡、分光光度法检测细胞谷胱甘肽(GSH)含量。结果:10μmol.L-1的米非司酮对K562/ADM细胞无明显杀伤,可有效逆转K562/ADM细胞耐药性,此浓度米非司酮联合As2O3(2.0μmol.L-1)作用于K562/ADM细胞后,逆转倍数明显增高(P<0.01),GSH含量明显低于同浓度单用药组(P<0.05)。对细胞增殖抑制及其诱导凋亡的效果均明显高于同浓度单用药组(P<0.05)。结论:米非司酮联合As2O3逆转作用增强,机制可能与凋亡加强及GSH含量改变有关。