DNA甲基化介导miR-128-2沉默对子宫内膜癌细胞中DJ-1表达的影响

目的在子宫内膜癌细胞系水平,进一步明确上调子宫内膜癌细胞内DJ-1表达的重要调控机制。方法1.利用正常人子宫内膜上皮细胞(ESC)和4种子宫内膜癌细胞株,检测细胞中miR-128-2基因启动子区DNA甲基化的水平、miR-128-2、DJ-1 mRNA及DJ-1蛋白表达水平,比较分析它们在不同的子宫内膜癌细胞系中的差异变化及相关性。2.将miR-128-2 mimic和miR-128-2 inhibitor依次分别转染Ishikawa和SPEC-2子宫内膜癌细胞株,测定细胞中miR-128-2、DJ-1 mRNA及DJ-1蛋白表达水平的变化,以求阐明miR-128-2是否能调控内源性DJ-1表达。3.分别构建含野生型DJ-1-3’UTR的重组荧光素酶报告载体pGL3-DJ-1-3’UTR-wt和含有突变型DJ-1-3’UTR的重组荧光素酶报告载体pGL3-DJ-1-3’UTR-mut,验证DJ-1是否为miR-128-2直接靶基因。4.Ishikawa和SPEC-2子宫内膜癌细胞经5μM甲基化抑制剂5-氮杂-2’-脱氧胞苷(5-Aza-dC)药物预处理48 h或5-Aza-dC预处理后再转染miR-128-2 inhibitor 48 h,随后检测miR-128-2基因启动子DNA甲基化水平的变化、miR-128-2和DJ-1 mRNA表达丰度的变化、DJ-1蛋白的表达水平变化,以求阐明子宫内膜癌细胞中miR-128-2基因启动子DNA甲基化是否沉默miR-128-2表达进而上调DJ-1表达。结果1.与正常ESC相比较,Ishikawa、RL95-2、KLE及SPEC-2四种子宫内膜癌细胞中miR-128-2基因启动子区DNA甲基化水平均显著增加(P<0.01),同时miR-128-2表达明显下调(P<0.01),而DJ-1 mRNA及蛋白表达显著增加(P<0.01);通过相关性分析发现miR-128-2甲基化水平与miR-128-2表达具有显著负相关性(r=-0.9124,P<0.01),而与DJ-1 mRNA表达具有显著正相关性(r=0.8304,P<0.01);此外,miR-128-2表达与DJ-1 mRNA的表达表现为负相关性(r=-0.8963,P<0.01)。2.Ishikawa和SPEC-2细胞中转染miR-128-2 inhibitor后,DJ-1 mRNA及蛋白表达水平较对照组均有明显升高(P<0.01),而miR-128-2 mimic转染细胞后,DJ-1 mRNA及蛋白表达水平较对照组均出现明显下降(P<0.01)。3.miR-128-2 mimic转染细胞后,重组报告质粒pGL3-DJ-1-3’UTR-wt的荧光素酶活性大幅降低(P<0.01),但miR-128-2 mimic对重组报告质粒pGL3-DJ-1-3’UTR-mut的荧光素酶活性却无法产生作用(P>0.05),提示miR-128-2可直接与DJ-13’UTR靶向结合。4.经5μM甲基化抑制剂5-Aza-dC预处理48 h后,Ishikawa及SPEC-2细胞中miR-128-2甲基化水平均显著下降(P<0.01),miR-128-2表达均显著上升,而DJ-1 mRNA和蛋白表达水平均显著下降(P<0.01)。此外,5-Aza-dC预处理上调miR-128-2表达并下调DJ-1 mRNA和蛋白表达的作用可被miR-128-2 inhibitor所逆转(P<0.01),然而,5-Aza-dC预处理降低miR-128-2甲基化水平的作用却未能被miR-128-2 inhibitor影响。结论子宫内膜癌细胞中DJ-1的表达可由miR-128-2直接靶向负调控;miR-128-2基因启动子区DNA甲基化致miR-128-2表达沉默可能是子宫内膜癌细胞中上调DJ-1表达的关键机制。

铁死亡相关基因影响肝细胞癌肿瘤微环境及预后风险研究

目的:通过生物信息学方法,揭示肝细胞癌(hepatocellular carcinoma,HCC)的异质性,探讨铁死亡相关基因与HCC肿瘤微环境(tumor microenvironment,TME)的关系,并构建基于铁死亡相关基因的预后模型,为预防HCC患者复发提供新的思路。方法:基于TCGA数据库和NODE数据库,利用非负矩阵分解聚类分析鉴定分子亚型,通过ESTIMATE算法和CIBERSORT算法用于构建免疫评分,利用Cox回归进行拟合风险评估模型并计算风险得分,并基于风险得分及临床信息构建列线图,利用体外实验验证mRNA的表达水平。结果:HCC的异质性体现为两种不同铁死亡相关的免疫分子亚型,其免疫评分差异显著(P<0.001)。筛选出G6PD、KIF20A、RRM2和TXN四个最佳候选铁死亡相关基因,并进行拟合构建风险评估模型,列线图对HCC患者的复发具有良好的预测能力。体外实验提示四个最佳候选基因均在人肝癌细胞表达水平增高(P<0.05)。结论:HCC可分为两种分子亚型,分子亚型与HCC的复发有关,铁死亡在TME中可能起着关键作用。四个铁死亡相关基因可能是预防HCC复发的潜在因素,预后模型对HCC复发有一定的预测价值。