抑制EB病毒阳性弥漫性大B细胞淋巴瘤增殖的抗TMD5单克隆抗体的筛选和效果评价

目的:筛选抗爱泼斯坦—巴尔病毒(EBV)潜伏期膜蛋白-1中跨膜结构域5(TMD5)单克隆抗体并评价其抑制EB病毒阳性弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)的效果。方法:人工合成TMD5肽段,用此TMD5肽段免疫BALB/c小鼠;PEG法制备杂交瘤;ELISA法筛选阳性杂交瘤细胞;有限稀释法制备单克隆;使用阳性孔单克隆细胞免疫小鼠制备腹水;western blotting法和ELISA法分别对腹水中的单克隆抗体进行鉴定和效价测定;体外CCK-8法测定腹水对Sp2/0细胞存活能力的影响;Annexin VFITC/PI双标记流式细胞术测定腹水对Sp2/0细胞凋亡率的影响;在体内裸鼠荷瘤实验测定腹水对裸鼠荷瘤生长的影响。结果:成功备制13个杂交瘤,其中3个为阳性杂交瘤,分别为2B11、5D07和6F04,阳性率为23%。以5D07孔单克隆细胞制备的腹水以1∶105稀释后,阳性/阴性腹水单克隆抗体抗TMD5效价比为6.763,阳性/Sp2/0的效价比为5.952,效价最高。与PBS组相比,2B11组和5D07组DB细胞48 h和72 h增殖能力降低,凋亡率升高,裸鼠荷瘤较小(P<0.05),6F04组上述测定指标无明显差异(P>0.05)。与2B11组相比,5D07组DB细胞48 h和72 h增殖能力降低,凋亡率升高,裸鼠荷瘤较小(P<0.05)。结论:通过杂交瘤法筛选出的5D07单克隆抗体抗TMD5效价高,在体外和在体裸鼠荷瘤实验抗EBV+DLBCL淋巴瘤活性良好。

靶向EBV潜伏膜蛋白1的单克隆抗体促进HIV相关EBV阳性伯基特淋巴瘤细胞凋亡的分子机制

目的制备和筛选抑制伯基特淋巴瘤(Burkitt lymphoma,BL)的抗EBV潜伏膜蛋白1(latent membrane protein-1,LMP1)单克隆抗体。方法人工合成EBV潜伏膜蛋白1的跨膜结构域5(transmembrane domain 5,TMD5),并以此为抗原,采用杂交瘤法制备抗TMD5单抗。ELISA法测定小鼠腹水中的抗体效价。7-氨基放线菌素D(7-Aminoactinomycin D,7-AAD)/Annexin V-PE双标记流式细胞术和JC-1染色联合流式细胞术测定线粒体膜电势评估单抗对BL细胞系Daudi细胞的促凋亡活性。蛋白质印迹法测定Daudi细胞内促存活信号通路p38-MAPK/IKK/NF-κB相关蛋白的表达水平。结果经过2轮筛选,获得R2-2-5E-6C和R2-2-8D-3A两种单抗,这2种单抗均能与TMD5发生抗体-抗原特异性结合,而与GAPDH无免疫反应。与NC组相比,R2-2-5E-6C组和R2-2-8D-3A组处理后的Daudi细胞中Annexin V+7-AAD+细胞所占百分比增加;JC-1荧光强度<104的细胞所占百分比增加;胞内p38-MAPK、IKK和NF-κB的表达水平降低(P<0.05)。结论筛选获得的抗TMD5单抗R2-2-5E-6C和R2-2-8D-3A可通过抑制LMP1介导的p38-MAPK/IKK/NF-κB信号通路的活性促进BL凋亡。