黄芪甲苷通过调控Caspase-1介导的经典焦亡途径抑制细胞焦亡缓解脑缺血/再灌注损伤的研究

目的:探讨黄芪甲苷对缺血/再灌注(I/R)损伤脑组织的干预作用及对Caspase-1信号通路介导的细胞焦亡的影响。方法:将SD大鼠随机分为4组,分别为假手术组(Sham)、模型组(MCAO/R)、溶剂对照组(DMSO)和黄芪甲苷组(AS-Ⅳ)。大脑中动脉阻塞2 h、再灌注24 h构建大鼠脑I/R损伤模型。大鼠神经功能缺损情况采用Zea Longa评分评估,脑梗死体积采用TTC染色法进行观察,脑组织病理损伤采用HE染色法分析,采用Caspase-1和TUNEL免疫荧光双染色法观察脑组织细胞焦亡,Western blot分析脑组织内NLRP3、Cleaved Caspase-1、IL-18、IL-1β等通路蛋白表达。结果:通过构建大脑MCAO/R模型发现,黄芪甲苷可有效改善脑I/R损伤大鼠神经功能,缩小脑梗死体积,缓解梗死侧神经细胞的坏死、丢失情况,并通过调控Caspase-1介导的经典焦亡途径抑制细胞焦亡。结论:黄芪甲苷可能通过调控Caspase-1介导的经典焦亡途径抑制神经细胞焦亡,缓解脑I/R损伤。

淫黄葛合剂对APP/PS1 HAMP^(-/-)小鼠认知功能和铁死亡氨基酸代谢通路的影响

目的:探究淫羊藿苷-黄芪甲苷-葛根素(淫黄葛)合剂(YHG)对铁调素(hepcidin,HAMP)基因敲除的APPswe/PS1dE9(APP/PS1 HAMP^(−/−))小鼠认知功能及铁死亡氨基酸代谢通路的影响。方法:实验分为阴性对照(C57BL/6小鼠)组、APP/PS1组、APP/PS1 HAMP^(−/−)组、APP/PS1+YHG组、APP/PS1 HAMP^(−/−)+YHG组、APP/PS1+地拉罗司(DFX)组和APP/PS1 HAMP^(−/−)+DFX组,每组6只。YHG(淫羊藿苷、黄芪甲苷和葛根素的剂量分别为120、80和80 mg/kg)和DFX(100 mg/kg)灌胃给药,C57组、APP/PS1组和APP/PS1 HAMP^(−/−)组小鼠给予等体积蒸馏水灌胃,每日一次,用药2个月。采用组织铁试剂盒检测小鼠脑组织铁离子含量;透射电镜检测小鼠海马神经元线粒体形态学变化;Morris水迷宫检测小鼠学习记忆能力;免疫荧光法检测各组小鼠脑组织神经元核抗原(NeuN)的含量;生化试剂盒检测小鼠脑组织谷胱甘肽(GSH)表达情况;Western blot检测小鼠脑组织谷氨酸半胱氨酸连接酶催化亚基(GCLC)和谷氨酰胺酶2(GLS2)的表达情况。结果:与C57BL/6小鼠相比,APP/PS1小鼠脑铁含量显著升高(P<0.01),线粒体形态破坏严重,学习记忆能力显著下降(P<0.05),脑组织神经元损伤严重(P<0.01),GSH、GCLC和GLS2表达水平均显著降低(P<0.01);与APP/PS1小鼠相比,APP/PS1 HAMP^(−/−)小鼠脑铁含量显著升高(P<0.01),线粒体形态破坏严重,学习记忆能力显著下降(P<0.05),脑组织神经元损伤严重(P<0.01),GSH、GCLC和GLS2表达水平显著降低(P<0.05);使用YHG和DFX后各组小鼠脑铁含量显著降低(P<0.01),线粒体形态破坏减轻,学习记忆能力显著升高(P<0.05),脑组织神经元损伤减轻(P<0.01),GSH、GCLC和GLS2表达水平显著升高(P<0.05)。结论:YHG可改善APP/PS1 HAMP^(−/−)小鼠学习记忆能力,其机制可能与调节铁死亡氨基酸代谢、增强抗氧化能力有关。

淫黄葛合剂对APP_(swe)/PS1_(dE9)小鼠行为及 海马胱氨酸/谷氨酸反向转运体的影响

目的观察淫黄葛合剂对APP_(swe)/PS1_(dE9)小鼠行为及海马胱氨酸/谷氨酸反向转运体的表达影响。方法6只8月龄雄性C57BL/6J小鼠为正常组,18只8月龄雄性APP_(swe)/PS1_(dE9)小鼠随机分为模型组、合剂组、地拉罗司(deferasirox,DFX)组,每组6只。正常组、模型组给予蒸馏水灌胃,合剂组灌胃淫黄葛合剂(淫羊藿苷120 mg·kg^(-1)、黄芪甲苷80 mg·kg^(-1)、葛根素80 mg·kg^(-1)),DFX组灌胃DFX(100 mg·kg^(-1)),每日1次,干预2个月。利用八臂迷宫实验检测各组小鼠空间、学习记忆能力;免疫荧光观察正常组、模型组小鼠海马CA3区溶质载体家族7成员11(solute carrier family 7 member 11,SLC7A11)与溶质载体家族3成员2(solute carrier family 3 member 2,SLC3A2)的表达水平;Western blot和real time q-PCR检测各组小鼠海马SLC7A11、SLC3A2蛋白及mRNA表达水平。结果与正常组相比,模型组小鼠空间学习记忆能力下降,海马CA3区SLC7A11、SLC3A2表达下降(P<0.05),海马SLC7A11、SLC3A2蛋白及mRNA表达下降(P<0.05);与模型组相比,合剂组、DFX组空间学习记忆能力提升,海马SLC7A11、SLC3A2蛋白及mRNA表达上升(P<0.05);合剂组与DFX组各项指标差异无统计学意义(P>0.05)。结论淫黄葛合剂可以改善APP_(swe)/PS1_(dE9)小鼠的行为障碍,其机制与促进海马SLC7A11、SLC3A2的表达有关。

补阳还五汤通过miR-148a-3p抑制大鼠星形胶质细胞凋亡而减轻脑缺血再灌注损伤

目的:探究补阳还五汤是否通过激活微小RNA-148a-3p(miR-148a-3p)靶向调控胶质细胞原纤维酸性蛋白(GFAP)而抑制大鼠氧糖剥夺/复氧复糖(OGD/R)星形胶质细胞凋亡。方法:取对数生长期的大鼠星形胶质细胞系CTX TNA2,随机分为5组:空白对照组(CON组)、模型组(OGD/R组)、补阳还五汤含药血清(BYHWDS)组、miR-148a-3p抑制物组(inhibitor组)和BYHWDS+inhibitor组,每组每种检测重复3次。除CON组外,其余各组氧糖剥夺6 h后复氧复糖24 h,并于复氧复糖的同时给予相应药物处理(但转染于造模前操作)。采用倒置相差显微镜观察细胞形态变化;MTS法检测各组细胞活力变化;qRT-PCR检测miR-148a-3p、GFAP mRNA和caspase-3 mRNA的表达水平;Western blot检测GFAP、Bax、Bcl-2、caspase-3、cleaved caspase-3、caspase-9和cleaved caspase-9蛋白水平;annexin V-FITC/PI染色检测CTX TNA2细胞的凋亡情况;免疫荧光双染观察GFAP、caspase-3、Bcl-2和Bax的表达情况。结果:与CON组相比,OGD/R组和inhibitor组的细胞皱缩,突起严重萎缩、变形,细胞碎片增多,细胞活力显著降低(P<0.01),miR-148a-3p表达水平降低(P<0.01),GFAP和caspase-3的mRNA表达水平均显著升高(P<0.01),GFAP蛋白表达水平,cleaved caspase-3/caspase-3、Bax/Bcl-2和cleaved caspase-9/caspase-9比值,以及细胞凋亡水平均显著升高(P<0.05)。与OGD/R组和inhibitor组相比,BYHWDS组和BYHWDS+inhibitor组细胞形态较损伤后有所恢复,突起萎缩减轻,连接有所增加,细胞活力显著升高(P<0.01),miR-148a-3p表达水平升高(P<0.01),GFAP和caspase-3的mRNA表达水平均显著降低(P<0.01),GFAP蛋白表达水平,cleaved caspase-3/caspase-3、Bax/Bcl-2和cleaved caspase-9/caspase-9比值,以及细胞凋亡水平均显著降低(P<0.05)。结论:补阳还五汤能上调miR-148a-3p表达而调低靶基因GFAP,从而抑制OGD/R大鼠CTX TNA2细胞凋亡,减轻脑缺血再灌注损伤,发挥神经保护作用。

还脑益聪方靶向HAMP调节铁代谢改善AD模型小鼠认知障碍的机制研究

目的探讨还脑益聪方(Huannao Yicong decoction,HYD)对APP/PS1小鼠学习记忆能力与脑铁代谢的影响以及HAMP基因敲除小鼠(HAMP^(-/-)小鼠)和APP/PS1双转基因模型小鼠的相关性。方法实验分5组,HAMP^(-/-)组:6月龄HAMP基因敲除小鼠;APP/PS1组:6月龄APP/PS1双转基因小鼠;HAMP^(-/-)+还脑益聪方组(HAMP^(-/-)+HYD);APP/PS1+还脑益聪方组(APP/PS1+HYD);阴性对照组:6月龄C57BL/6J小鼠,每组6只。还脑益聪方灌胃给药(还脑益聪方13.68 g·kg^(-1)体质量),其余各组给予蒸馏水灌胃,每天1次,给药2个月。给药结束后,Morris水迷宫测试每组小鼠学习记忆能力;生化法检测各小鼠脑组织铁含量;Western blot与RT-qPCR检测各组小鼠海马转铁蛋白(transferrin,TF)、转铁蛋白受体1(transferrin receptor1,TFR1)、膜铁转运蛋白1(ferroportin1,FPN1)蛋白、二价金属离子转运体1(divalent metal transporter1,DMT1)与β淀粉样蛋白(β-amyloid protein,Aβ)及mRNA表达水平。结果与正常组相比,HAMP^(-/-)组小鼠与APP/PS1组小鼠学习记忆能力均降低,脑组织铁含量升高,HAMP^(-/-)组与APP/PS1组小鼠海马中Aβ蛋白表达升高(P<0.01),TF、TFR1、DMT1蛋白及mRNA表达均升高(P<0.01),FPN1蛋白及mRNA表达降低(P<0.01);分别与HAMP^(-/-)组和APP/PS1组相比,HAMP^(-/-)+HYD组与APP/PS1+HYD组小鼠学习记忆能力均提高,脑组织铁含量降低,Aβ蛋白表达下降(P<0.01),TF、TFR1、DMT1蛋白及mRNA表达降低(P<0.01),FPN1蛋白及mRNA表达升高(P<0.01)。结论HAMP^(-/-)小鼠和APP/PS1小鼠之间具有一定关联性,HYD可以改善HAMP^(-/-)与APP/PS1小鼠学习记忆能力,减少Aβ沉积,其机制可能与调节TF、TFR1、DMT1、FPN1的表达,改善脑铁超载有关。