犬和猫皮肤癣菌三重荧光定量PCR检测方法的建立及应用

建立鉴别犬小孢子菌(Microsporum canis,MC)、须癣毛癣菌(Trichophyton mentagrophytes,TM)和秕糠马拉色菌(Malassezia furfur,MF)的三重荧光PCR检测方法,根据MC、TM和MF 3种真菌的ITS基因保守序列设计引物和探针,建立三重荧光PCR检测方法。所建立的三重荧光PCR方法仅对MC、TM和MF出现阳性扩增,与大肠埃希氏菌、产色葡萄球菌和铜绿假单胞菌等犬、猫皮肤病常见病原无交叉反应,对MC、TM和MF的最低检出限分别为1.36×10~1、1.35×10~1、1.33×10~1拷贝;组内和组间变异系数均小于2%,重复性好。应用建立三重荧光PCR方法对88份犬、猫临床样品进行检测,结果检出1份MC阳性、21份TM阳性、20份MF阳性,检测结果与单一荧光PCR方法一致。该方法可对MC、TM和MF同时快速检测,可用于犬、猫真菌性皮肤病的快速诊断。

母猪猪瘟病毒抗体与仔猪母源抗体衰减规律的研究

为了研究仔猪猪瘟病毒(CSFV)母源抗体的衰减规律,本研究随机选择36头待产母猪,产后采血,选择每头母猪对应的仔猪连续采血至8周龄,分离血清,通过ELISA方法检测CSFV抗体阻断率,所测结果利用EXCEL拟合指数曲线,计算分析母猪CSFV抗体水平与仔猪母源抗体衰减规律。结果显示,36头母猪中母猪抗体阻断率80%以上6头,母猪抗体阻断率70%~79%的11头,母猪抗体阻断率60%~69%的8头,母猪抗体阻断率50%~59%的5头,母猪抗体阻断率49%以下的6头。3周龄仔猪抗体阻断率整体与母猪抗体阻断率相近且高度相关,相关系数为99%。母猪抗体阻断率在80%以上时,母源抗体对所产仔猪8周龄时仍然具有保护力;母猪抗体阻断率在70%~79%时,母源抗体对所产仔猪7周龄时不再具有保护力;母猪抗体阻断率在60%~69%时,母源抗体对所产仔猪5周龄时不再具有保护力;母猪抗体阻断率在50%~59%时,母源抗体对所产仔猪4周龄时不再具有保护力;母猪抗体阻断率49%以下时,母源抗体对所产仔猪3周龄时不再具有保护力。以上结果表明仔猪母源CSFV抗体随着仔猪周龄的增加逐渐衰减,由试验得出仔猪猪瘟疫苗首免日龄的计算公式:y=1.19x-46.55(x为母猪CSFV抗体阻断率,y为首免日龄)。因此,母猪抗体阻断率在80%以上时,仔猪母源抗体在60日龄不再具有保护力,仔猪猪瘟疫苗首免为56日龄;母猪抗体阻断率在70%~79%时,母源抗体对仔猪的保护持续到50日龄,仔猪猪瘟疫苗首免为42日龄;母猪抗体阻断率在60%~69%时和50%~59%时,母源抗体对仔猪的保护持续至36日龄和29日龄,仔猪猪瘟疫苗首免分别为28日龄和21日龄。本研究中所得母猪CSFV抗体水平计算母源抗体衰减变化,为选择母猪首免日龄,提高仔猪猪瘟疫苗免疫效果提供了科学依据。

关于动物检疫中法律责任的思考

目前动物检疫与人们饭桌上的食品安全息息相关,日益受到重视。因此加强对动物检疫现状的分析至关重要,尤其是对动物检疫中法律责任的分析。本研究论述了动物检疫中的工作意义、工作要点和具体措施以及各个环节的法律责任。研究结果表明:各个环节涉及的单位和个人必须依法办事;检疫工作必须重视实验室检测;检测机构的选择和认定非常重要;明确好责任,做好追究溯源,令动物检疫科学规范。本研究对动物检疫科学规范管理,为今后《中华人民共和国动物防疫法》的完善起到参考借鉴作用,为防止疫情传播、促进当代畜牧业健康可持续发展提供理论支撑。

经分子佐剂诱导产生的卵黄抗体对NDRV的预防和治疗效力评价

为了预防和应对新型鸭呼肠孤病毒引起的综合疾病,本研究利用分离到的新型鸭呼肠孤病毒,制备了具有良好中和活性的高效价IgY。中和试验结果显示:三免后第14天抗体滴度达到峰值,而后趋于平稳(>26),且添加CpG和IL-2分子佐剂的组别提取的IgY比未添加分子佐剂的组别中和滴度提高约3倍;将抗体注入SPF鸡胚进行攻毒保护试验,结果显示中和组的保护率最高,预防组的略高于治疗组的,且CpG组所提取的IgY预防效果(83%)和治疗效果(75%)最佳。本研究提取的高效价IgY能应用到临床防控中,可有效预防及治疗新型鸭呼肠孤病毒病。

三种鸽源病毒多重PCR检测方法的建立及初步应用

为建立一种可以快速检测鸽疱疹病毒(Pi HV)、鸽圆环病毒(PiCV)和鸽源腺病毒(PiADV)的三重PCR方法,本研究针对3种病原的保守区域分别设计合成了3对特异性扩增引物,在优化反应体系、反应条件的基础上,分别对其特异性、敏感性和重复性进行验证,建立了能够快速检测以上3种病原的多重PCR方法,并对121份临床样品进行了检测。通过反应条件优化,确定PiHV、PiCV、PiADV引物体积比为1∶1∶2,退火温度为58℃时,扩增效果最好。敏感性试验显示,PiHV、PiCV和PiADV的最低检出量均为1.0×101copies/μL。特异性试验显示,建立的多重PCR方法与鸽新城疫病毒(NDV)、鸽痘病毒(PPV)、鸽轮状病毒(PiRV)没有特异性反应。利用本研究建立的多重PCR方法对121份临床样品进行检测,结果与单重PCR结果一致。综上所述,本研究建立的方法可用于鸽养殖场或公棚的PiHV、PiCV、PiADV快速检测。

基于重构NDRV σC 蛋白的间接ELISA抗体检测方法的建立

旨在建立灵敏快速诊断新型鸭呼肠孤病毒(novel duck reovirus,NDRV)抗体的间接ELISA(indirect ELISA,iELISA)方法,为水禽养殖业提供科学有效的检测手段。先前报道σC蛋白为沉淀表达,因此本研究利用大肠杆菌的密码子偏嗜性等规律优化其基因序列进行原核表达,纯化出高纯度的可溶性σC蛋白。采用方阵滴定法确定σC蛋白包被浓度和样品稀释度,初步建立NDRV的iELISA检测方法。分别对84份阳性和180份阴性质控血清进行分析,构建受试者工作特征曲线(ROC),通过Youden指数选择灵敏性和特异性最佳的P值作为阴阳临界值。使用质控阴、阳血清评价试剂盒的批内和批间重复性。用本研究的和实验室先前建立的全病毒包被的iELISA方法同时对质控血清进行检测,比较其符合率。通过方阵滴定法确定各组分条件为σC蛋白包被质量浓度0.5μg/孔、血清稀释度1∶320。构建的ROC曲线下面积为1.00,最佳阴阳临界值为0.076,在此临界值上的灵敏性和特异性均为100%。全病毒包被板和σC蛋白包被板符合率为100%,但前者检测样品的D_(450)值偏低,σC蛋白包被板则弥补了这一缺点。本研究为NDRV提供特异性和灵敏性良好的iELISA抗体检测方法。