刚地弓形虫棒状体蛋白18及其作为基因工程疫苗候选分子研究进展

刚地弓形虫棒状体蛋白18(rhoptry protein18,ROP18)是由棒状体分泌的、属于棒状体蛋白2家族的一员,具有丝氨酸/苏氨酸激酶活性,在虫体入侵和毒力的发挥方面起着重要作用。论文就ROP18蛋白的结构、毒力和作用机制及其作为基因疫苗候选分子的研究现状进行综述。

流感嗜血杆菌耐药性的研究进展

流感嗜血杆菌 （Haemophilus influenzae,Hi ）是一种没有运动力的革兰氏阴性杆菌，于1892年由费佛博士在流行性感冒的瘟疫中发现，是一类兼性厌氧生物[1]。流感嗜血杆菌最初被误认为是流行性感冒的病原菌，直至1933年流行性感冒的病毒性病原被发现后，这种误解才得以消除。

衣原体与宿主细胞相互作用研究进展

衣原体是专性细胞内寄生、有独特发育周期的原核细胞型微生物,为了建立有益于病原体复制的细胞内环境,衣原体依赖于它们操纵宿主细胞内环境的能力,并且进化成了与宿主细胞相互作用的复杂机制,本文从感染衣原体后宿主细胞变化、免疫反应及蛋白质组改变等几个方面简要综述了衣原体与宿主细胞相互作用的最新进展,为进一步研究衣原体致病机制提供参考。

肺炎衣原体Taqman探针实时荧光定量PCR检测法

目的针对Cpn0308基因建立检测肺炎衣原体的Taqman探针实时荧光定量PCR(FQ-PCR)方法。方法根据肺炎衣原体包涵体膜蛋白Cpn0308基因序列设计引物和Taqman探针,建立Taqman FQ-PCR检测体系,对反应体系进行优化,进行灵敏度、特异性、重复性评价;并与商品化肺炎衣原体核酸检测试剂盒检测临床标本进行对比分析。结果肺炎衣原体Taqman FQ-PCR方法的引物浓度300 nmol/L,探针浓度200 nmol/L,Mg^(2+)4.0 mmol/L为最优反应条件;灵敏度为8.36×102copies/μL;该法对常见几种呼吸道病原菌及沙眼衣原体无交叉反应;重复性试验中4个浓度变异系数均小于3%。自建方法与商品化试剂盒对呼吸道感染组、心血管疾病组及正常对照组标本检出率分别为10%vs 10%(χ~2=0.167,P>0.05),44.44%vs 40.74%(χ~2=0,P>0.05),6.67%vs 3.33%(χ~2=0,P>0.05),各组阳性率间差异无统计学意义;2种方法的总阳性率(16.54%vs 14.96%)比较差异无统计学意义(χ~2=0.071,P>0.05)。结论本研究建立的Taqman探针实时荧光定量PCR检测肺炎衣原体的方法灵敏度好,特异性高,重复性好,可应用于临床肺炎衣原体核酸检测。

1株抗生素耐药微小脲原体hebnu3h07的全基因组测序及序列分析

目的对1株从患者标本分离出的具有耐药性的微小脲原体hebnu3h07进行全基因组测序和生物信息学分析,为深入研究微小脲原体的基因组学特征及耐药机制提供依据。方法对从临床分离的微小脲原体hebnu3h07株进行培养鉴定并进行药敏试验,采用Ion torrent高通量测序技术对其进行全基因组测序,再使用相关软件对测序数据进行基因组组装、基因预测与功能注释、共线性分析、直系同源簇(COG)聚类分析、菌株分型和介导耐药的相关基因检测分析。结果微小脲原体hebnu3h07株对数种抗生素表现出不同程度的耐药性,其完整基因组大小为723 292bp,GC含量为25.4%,与现存3株微小脲原体完整序列比对发现其基因组序列较为保守,多位点序列分型属于ST1型,对介导耐药的基因检测发现数个突变位点。结论通过对此株抗生素耐药的微小脲原体的全基因组测序和导致耐药的基因位点分析,丰富了我国微小脲原体基因组数据,为微小脲原体的耐药机制研究提供了依据。

甘露聚糖结合凝集素相关蛋白19(MAp19)在HeLa细胞的表达

目的构建甘露聚糖结合凝集素相关蛋白19(MAp19)真核表达载体并表达MAp19。方法应用PCR技术扩增得到MAp19基因,利用基因克隆技术构建真核表达载体pc DNA3.1/Myc-His A-MAp19,酶切及测序对其进行鉴定;将构建成功的重组载体通过脂质体转染He La细胞,并采用G418筛选已获得整合有pc DNA3.1/Myc-His A-MAp19的阳性细胞克隆,用荧光显微镜观察MAp19融合蛋白在He La细胞的定位;Western blot法检测MAp19融合蛋白的水平。结果构建了具有筛选特征和能够稳定表达的pc DNA3.1/Myc-His A-MAp19重组质粒,测序结果与NCBI数据库比对完全一致;采用G418筛选后获得表达外源性MAp19蛋白的He La细胞,该蛋白定位于细胞质中;Western blot结果确定MAp19为分泌性蛋白。结论 MAp19真核表达载体构建成功,并能在真核细胞中表达出目的蛋白。

神经退行性疾病潜在致病肺炎衣原体蛋白Cpn0147酵母双杂交诱饵载体的构建

目的:构建Cpn0147酵母双杂交诱饵载体,为应用酵母双杂交系统筛选与其相互作用的蛋白奠定基础。方法:应用聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)扩增技术获得Cpn0147基因片段,克隆入pGBKT7载体,鉴定构建是否成功,确定构建成功后将重组载体pGBKT7-Cpn0147转入AH109及Y187酵母中,进行诱饵载体的毒性及自激活活性分析。结果:Cpn0147诱饵载体构建成功,且该诱饵载体无自激活活性,对两种宿主酵母细胞无毒性。结论:诱饵载体pGBKT7-Cpn0147可用于酵母双杂交系统,为进一步筛选与之相互作用蛋白提供了实验基础。

张家口地区388例变应性鼻炎患者吸入性变应原谱及危险因素分析

目的探讨张家口地区变应性鼻炎(AR)患者吸入性变应原的分布情况及相关危险因素。方法对2019年4月-2020年8月就诊于河北北方学院附属第一医院耳鼻咽喉头颈外科的532例疑似AR患者进行变应原血清特异性IgE检测,选取同期该院门诊及住院患者家属(呼吸科、皮肤科及耳鼻喉科家属除外)245名设为对照组,对AR患者和对照组进行AR问卷调查,统计分析调查结果。结果532例疑似AR患者中,388例(72.9%)至少一种变应原呈阳性。AR患者阳性率排名前3位的吸入性变应原依次为艾蒿(89.9%)、普通豚草(44.1%)、猫上皮(21.4%)。在单一变应原阳性患者中,艾蒿阳性检出率(86.0%)明显高于其他变应原。在变应原的阳性程度分布中,艾蒿以2级、3级及6级为主,屋尘和屋尘螨以1级为主,其他变应原均以2级为主。不同月份、地区、年龄段的AR患者变应原阳性检出率差异有统计学意义(P<0.05),7~9月份的变应原阳性检出率明显高于其他月份、坝上地区明显高于坝下地区,且变应原阳性率随年龄增长而逐渐降低。不同性别AR患者普通豚草、猫上皮、屋尘、屋尘螨及交链孢霉5种吸入性变应原的阳性检出率差异有统计学意义(P<0.05)。多因素logistic回归分析结果显示,既往过敏史、父/母患AR、哮喘史、吸二手烟、熬夜以及年龄3~24岁为AR发病的高危因素(OR>1);经常锻炼身体为AR的有效保护因素(OR<1)。结论张家口地区的主要吸入性变应原为艾蒿、普通豚草。变应原的分布与月份、地区及患者的性别、年龄具有一定相关性。发生AR的危险因素主要有既往过敏史、哮喘史、父/母患AR、年龄等。

张家口地区18岁以下变应性鼻炎患者变应原检测结果分析

目的分析张家口地区18岁以下变应性鼻炎(AR)患者的变应原检测结果,了解本地区AR患者食入性、吸入性变应原的分布情况。方法选择2019年4月至2020年11月就诊于河北北方学院附属第一医院耳鼻咽喉-头颈外科454例18岁以下有AR临床表现的患者作为研究对象,通过酶联免疫捕获法对患者血清进行15种变应原特异性IgE抗体检测,分析变应原在不同年龄段、性别、就诊月份的差异。结果454例患者中,438例(96.48%)至少有1种变应原阳性,吸入性变应原阳性率为71.59%(325/454),其中艾蒿的阳性率最高(52.20%,237/454),其次为普通豚草(28.85%,131/454)、屋尘(28.85%,131/454);食入性变应原阳性率为67.18%(305/454),其中以鸡蛋和牛奶的阳性率较高[分别为55.51%(252/454)、34.14%(155/454)]。变应原总阳性率、吸入性变应原总阳性率、食入性变应原总阳性率在1-6岁组、7-14岁组和15-17岁组之间差异有统计学意义(P<0.01)。两两比较显示,1-6岁组吸入性变应原阳性率低于7-14岁组(χ^(2)=18.897,P<0.001),15-17岁组与1-6岁组、7-14岁组的差异均无统计学意义(χ^(2)=3.959,P=0.047;χ^(2)=0.818,P=0.366);食入性变应原阳性率1-6岁组高于7-14岁组及15-17岁组,且7-14岁组高于15-17岁组,差异均有统计学意义(P均<0.001)。进一步比较分析发现,艾蒿、普通豚草、猫上皮、柳树、粉尘螨、屋尘螨、屋尘、鸡蛋、牛奶的阳性率在3个年龄组间差异均有统计学意义(P均<0.05)。男性AR患者艾蒿、普通豚草、猫上皮、交链孢霉变应原的阳性率均高于女性(P均<0.05)。AR患者主要以单一变应原致敏为主(29.45%,129/438),变应原阳性个数与患者的性别无关。AR患者就诊人数于8月份达到高峰(37.22%,169/454)。结论张家口地区18岁以下AR患者的主要吸入性变应原为艾蒿、普通豚草、屋尘,食入性变应原为鸡蛋、牛奶。随着患者年龄的增长食入性变应原阳性率逐渐降低。AR患者以单一变应原为主,就诊人数于8月份达到高峰。

噬菌体展示疫苗的研究进展

噬菌体是感染细菌、真菌、放线菌和螺旋体等微生物的病毒,因其固有的免疫原性、遗传可塑性、稳定性及安全性等优势,使其在疫苗研发中具有独特的潜力。目前,有较多利用其构建疫苗递送平台的研究,主要包括噬菌体展示疫苗、噬菌体DNA疫苗及杂交噬菌体DNA疫苗3种形式,其中研究最为广泛的是噬菌体展示疫苗。噬菌体展示技术是一种新型疫苗制备技术,是以噬菌体为载体,通过将外源多肽或蛋白基因整合至噬菌体基因中,以融合蛋白的形式展示在噬菌体表面的分子生物学技术。本文主要就噬菌体展示疫苗的免疫学基础、展示系统及其在疾病预防应用的研究进展作一综述,以期为噬菌体展示疫苗的研发与应用提供参考。

微小脲原体UP3-00830基因原核表达载体的构建表达及生物信息学分析

目的 构建微小脲原体UP3-00830基因原核表达载体,诱导表达蛋白并进行生物信息学分析。方法 通过PCR方法扩增UP3-00830基因。双酶切目的基因和载体质粒pGEX-6P-2,经T4连接酶连接,连接产物转化XL1-Blue感受态,经10 mmol/L IPTG诱导表达GST-UP3-00830融合蛋白,运用生物信息学软件预测UP3-00830基因编码的假设蛋白的功能。结果 成功构建了pGEX-6p-2-UP3-00830重组质粒,测序后与NCBI中录入的序列进行比对,同源性为99.85%。将重组质粒转染大肠埃希菌后经10 mmol/L IPTG诱导,表达相对分子质量为51×10^(3)的GST-UP3-00830融合蛋白,与预期相符。采用生物信息学软件分析UP3-00830基因编码的假设蛋白,其分子式为C_(1150)H_(1846)N_(302)O_(356)S_(4),理论相对分子质量为25.73×10^(3),理论等电点(pI)为5.19,氨基酸数目为218,氨基酸组成中的赖氨酸(Lys)所占比例最高。含有α-螺旋、延伸链、无规则卷曲和β-转角,无跨膜区域和信号肽区域,第178-216位为卷曲螺旋区域。高级结构分析显示,UP3-00830基因编码的假设蛋白与蛋白库中1zxj.1相似性最高,为31.05%;结构及功能预测显示该蛋白具有蛋白转运和蛋白折叠的功能,与其相邻的蛋白分别为UU067、fecE(UU069)、hmuU-1(UU070)和ABCsbp-4(UU071)。结论 成功构建UP3-00830基因原核表达载体,并诱导表为51×10^(3)的目的蛋白,该蛋白可能参与物质转运和信号转导。

刚地弓形虫ROP16基因的克隆及生物信息学分析

目的构建刚地弓形虫棒状体蛋白16(TgROP16)真核重组表达载体,对TgROP16基因编码蛋白进行生物信息学分析。方法提取刚地弓形虫总RNA,根据TgROP16基因的开放阅读框架设计引物,采用逆转录PCR(RTPCR)扩增ROP16基因,经EcoR I、Not I酶切后连接入真核表达载体pVAX1中,连接产物转化大肠埃希菌(E.coli)XL1-Blue。提取阳性菌落质粒,进行PCR、双酶切鉴定及基因测序,对所获序列进行生物信息学分析。结果 TgROP基因RT-PCR扩增产物与预期一致,大小约为2 100bp。重组质粒经PCR及双酶切鉴定构建正确。测序显示获得的TgROP16基因片段为2 124bp,与GenBank已收录的弓形虫ROP16基因序列(登录号为GQ249093.1)比对,一致性为99.8%。预测其编码蛋白TgROP16为非跨膜分泌蛋白,含707个氨基酸,分子式为C3343H5339N967O1024S2,分子质量单位为76.1352ku,理论等电点为9.18;在TgROP16蛋白的二级结构中α-螺旋、延伸链、β-转角和无规则卷曲分别占比35.79%、14.29%、7.07%和42.86%;含多个可形成卷曲螺旋构象的区域与可成为磷酸化位点的氨基酸残基,存在信号肽序列,含39个B细胞抗原表位、24个CTL细胞抗原表位及33个Th细胞抗原表位。结论成功构建了pVAX1-ROP16真核表达重组质粒,生物信息学分析表明其编码蛋白TgROP16具有良好的抗原性及免疫原性,有望作为弓形虫疫苗候选分子。

刚地弓形虫棒状体蛋白10的生物信息学分析

目的对刚地弓形虫棒状体蛋白10(TgROP10)进行生物信息学预测,分析其免疫原性。方法运用生物信息学在线分析程序ProtParam、SOSUI、ProtScale、TMHMM、SignalP-4.1、TargetP1.1Server、SOPMA、MotifScan、SWISS-MODEL、SYFPEITHI和Bcepred等并结合生物信息学软件DNASTAR和DNAMAN分析预测TgROP10的理化性质、可溶性、亲疏水性、跨膜结构域、信号肽、胞内定位、二级结构、蛋白翻译后修饰位点、三级结构、柔韧性、表面可及性和B细胞、T细胞抗原表位等。结果 TgROP10蛋白由586个氨基酸组成,分子式为C2562H4045N739O964S9,分子质量单位(Mr)为60.912 21×103,理论等电点为4.19,吸光度值为0.476,半衰期为30h,不稳定系数为55.56,脂溶性指数为56.25,总平均亲水性系数为-0.699,属于亲水性蛋白;该蛋白无跨膜结构区域,信号肽切割位点在22-23位氨基酸之间,亚细胞定位预测可能是分泌蛋白;二级结构中α螺旋和β折叠分别占26.79%和13.31%,β转角和无规则卷曲分别占6.48%和53.41%,有6种翻译后修饰位点,15个B细胞抗原表位,3个CTL细胞抗原表位,12个Th细胞抗原表位,28个亲水性参数得分1.9的区域,15个柔韧性参数得分2.0的区域,27个表面可及性参数得分1.9的区域,3个暴露表面参数得分2.3的区域。结论生物信息学预测TgROP10含多个抗原表位,具有免疫原性,可作为弓形虫疫苗备选蛋白。

衣原体分泌蛋白的研究进展

衣原体通过其自身产生的分泌蛋白实现与宿主的相互作用,此类蛋白主要包括分泌到包涵体膜上(如包涵体膜蛋白等)、分泌到胞浆中(如CPAF、TARP等)及其他分泌蛋白(SINC)。近年来出现了关于不同类型分泌性蛋白的最新研究成果,本综述主要对这些分泌性蛋白的一些新功能进行了论述。

CPn0308免疫性检测方法的建立及在感染肺炎衣原体人群中的初步应用

肺炎衣原体（CPn）感染可能与心脑血管疾病的发生相关,在感染人群中表现出一定的免疫应答,CPn0308是新发现的包涵体膜蛋白,是否在自然感染人群中具有免疫应答值得研究.

微小脲原体3-00990的生物信息学分析与原核表达

目的探讨微小脲原体(UP)3-00990基因功能,对其进行生物信息学分析;并构建其原核表达载体。方法通过在线软件ProtParam、ALPHLYSE、TMHMM、php等数据库分析UP3-00990基因的生物信息学特征,构建UP3-00990基因的原核表达载体。结果生物信息学分析结果显示,UP3-00990蛋白分子式为C878H1323N235O330S18,理论等电点为4.19,性质不稳定,且为亲水性蛋白质;三维结构无规则且卷曲较多,存在信号肽;可能具有与DNA连接酶相似的功能。同时UP3-00990基因原核表达载体构建成功并表达了融合蛋白。结论推测UP3-00990蛋白可能参与了UP损伤修复及质量控制等,可为进一步研究UP的分子机制提供基础。

衣原体脂质代谢研究进展

衣原体是一种革兰氏阴性的专性细胞内病原体,是人类生殖道、眼和呼吸道感染的重要原因。它在一种被称为包涵体的专门膜结合区室中复制,并通过分泌的效应子在宿主的敌对细胞内环境中存活,但需要宿主衍生的脂质才能在细胞内生长和发育。新兴证据表明衣原体已经进化出多种策略,通过与宿主细胞区室相互作用,将运输途径重定向到其细胞内利基来满足其脂质需求。本文就衣原体获取宿主脂质的途径及其代谢机制展开简要叙述。

刚地弓形虫ROP16-ROP18复合基因真核表达载体的构建

目的构建刚地弓形虫棒状体蛋白16(TgROP16)、棒状体蛋白18(TgROP18)复合基因真核表达重组质粒,并验证其在真核细胞中的表达情况。方法重组质粒pVAX1-ROP16与pVAX1-ROP18分别经EcoRⅠ和NotⅠ、NheⅠ和AflⅡ双酶切,将ROP16与ROP18基因先后克隆至双启动子真核表达载体质粒pVAXD的多克隆位点中,构建pVAXD-ROP16-ROP18重组质粒。分别用双酶切和PCR验证正确的重组质粒及对照组质粒转染Hela细胞,提取细胞总RNA并逆转录为cDNA,以此为模板进行ROP16基因、ROP18基因与管家基因β肌动蛋白基因的RT-PCR扩增,采用间接免疫荧光法检测各自基因的表达。结果重组质粒pVAXD-ROP16-ROP18经PCR及双酶切鉴定构建正确。转染后经RT-PCR检测,实验组与对照组β-肌动蛋白基因扩增产物均与预期大小相符,实验组ROP16基因、ROP18基因扩增产物分别为1 700bp和2 100bp,与预期大小相符,而对照组均未扩增出ROP16及ROP18基因。间接免疫荧光法检测显示,重组质粒pVAXD-ROP16、pVAXD-ROP18转染组细胞可见绿色荧光,空质粒及对照组无绿色荧光。结论成功构建了重组质粒pVAXD-ROP16-ROP18,该质粒可在真核细胞中表达。

沙眼衣原体包涵体膜蛋白CT813真核表达载体的构建及表达

目的构建沙眼衣原体包涵体膜蛋白CT813真核表达载体并观察其在Hela细胞中的表达,为研究其与宿主间的相互作用奠定基础。方法克隆CT813基因,分别对CT813与pcDNA3.1/Myc-HisA空质粒进行双酶切,T4连接酶进行连接,然后进行菌落PCR、酶切及测序鉴定;将构建的重组质粒pcDNA3.1/Myc-HisA-CT813转染Hela细胞后采用Western blot与间接免疫荧光法检测目的蛋白表达。结果 PCR显示,扩增的目的基因片段约795bp,与预期相符;经NotⅠ与kpnⅠ双酶切鉴定重组质粒构建正确,测定其序列与NCBI数据库完全一致;Western blot显示重组质粒转化Hela表达的CT813融合蛋白分子质量单位为29.4kd左右;间接免疫荧光法检测该蛋白位于细胞胞浆中,是衣原体分泌性蛋白。结论成功构建了PcDNA3.1/Myc-His A-CT813真核表达载体并表达了沙眼衣原体包涵体膜蛋白CT813,对研究其生物学功能及与宿主配体间的相互作用具有重要意义。

刚地弓形虫ROP10-ROP18真核表达载体的构建与鉴定

目的构建刚地弓形虫棒状体蛋白10(ROP10)、棒状体蛋白18(ROP18)复合基因真核表达载体pVAXDROP10-ROP18,并在HeLa细胞内表达目的蛋白。方法设计ROP10、ROP18基因特异引物,采用RT-PCR扩增ROP10、ROP18基因并测序,将ROP10和ROP18基因分别定向插入双启动子真核表达载体pVAXD的多克隆位点中,构建单价质粒pVAXD-ROP10和pVAXD-ROP18,然后将ROP18基因插入pVAXD-ROP10中构建双启动子真核表达载体pVAXD-ROP10-ROP18。经PCR和双酶切验证后将pVAXD-ROP10-ROP18转染至HeLa细胞内,提取细胞总RNA并逆转录为cDNA,以此为模板分别进行ROP10基因和ROP18基因的RT-PCR鉴定;采用间接免疫荧光试验(IFA)检验ROP10和ROP18蛋白表达情况。结果成功克隆ROP10、ROP18基因片段并构建了重组质粒pVAXDROP10-ROP18,测序、双酶切和PCR验证重组质粒构建正确。分别将3种重组质粒转染至HeLa细胞后经RT-PCR鉴定,pVAXD-ROP10-ROP18组可同时扩增出1 761bp(ROP10基因)和1 665bp(ROP18基因)2个片段,而pVAXDROP10组和pVAXD-ROP18组分别扩增出1 761bp和1 665bp的目的片段;IFA显示pVAXD-ROP10组和pVAXDROP18组均有绿色荧光,即分别表达ROP10和ROP18蛋白。结论成功构建重组质粒pVAXD-ROP10-ROP18、pVAXD-ROP10和pVAXD-ROP18质粒可在真核细胞中分别表达ROP10和ROP18两种蛋白。