骨桥蛋白13肽抑制球囊内皮剥脱术后血管狭窄的实验研究

目的:利用含有骨桥蛋白(OPN)多种功能位点的13肽(Gly158-Lys170),从细胞和整体水平观察其对VSMC和单核巨噬细胞黏附、浸润以及内膜增生的影响,并初步探讨其作用机制。方法:用不同浓度OPN13肽(0,100,200,300mg/L)检测其对体外培养的平滑肌细胞(VSMC)与OPN黏附的抑制作用;以不含黏附序列的6肽分子为对照组,用以确定13肽抑制黏附特异性。用球囊内皮剥脱法建立大鼠内膜增生模型。实验动物分为4组:治疗组大鼠自术前1h及术后静脉滴注13肽,连续给药7d;对照组大鼠给予非特异性对照6肽分子;模型组大鼠给予相同剂量的生理盐水;正常对照组大鼠施假手术。并利用免疫组织化学染色和Western印迹分析方法,检测血管壁中OPN、FAK、ILK的表达变化。结果:OPN13肽能特异性的及浓度依赖性的抑制VSMC与OPN的相互作用,血管内膜剥脱后给予13肽治疗组血管壁单核/巨噬细胞浸润减少,OPN及其下游信号分子ILK,FAK表达下调,内膜增生被明显抑制。结论:含有OPN多功能位点的13肽可通过阻断OPN与膜受体的相互作用而抑制血管炎症的进展和内膜增生。

MMP-2基因启动子区-735C→T多态性与冠状动脉粥样硬化的相关性研究

目的:研究中国汉族人群基质金属蛋白酶2(MMP-2)基因启动子区-735C→T多态性与冠状动脉粥样硬化(CAS)的相关性。方法:用聚合酶链反应-限制性片段长度多态性(PCR-RFLP)分析法,以309例经冠状动脉造影确诊为冠状动脉粥样硬化的患者为研究对象,检测MMP-2基因启动子区-735C→T多态性,以311例同期体检的正常人为对照组,比较两组间MMP-2基因多态性频率分布的差异,并结合冠脉造影情况,探讨MMP-2基因多态性与CAS发病及冠状动脉狭窄程度的关系。结果:CAS组CC基因型频率(86.1%)明显高于对照组(79.7%),而CT+TT基因型频率(13.9%)明显低于对照组(20.3%),两组之间的差异显著(P<0.05);CAS组C等位基因频率(92.6%)高于对照组(89.1%),T等位基因频率(7.4%)低于对照组(10.9%),两组差异显著(P<0.05)。MMP-2基因-735C→T多态性与冠状动脉狭窄程度无关(P>0.05)。结论:MMP-2基因-735C→T多态性可能与中国汉族人群CAS有关,MMP-2基因CC基因型和C等位基因可能是CAS遗传易感性的基因标记之一。

旋覆花素抑制内皮剥脱诱导血管炎症反应的研究

目的探讨旋覆花素抑制血管内膜增生的药理学机制。方法SD大鼠灌胃服用旋覆花素溶液,3d后行球囊内皮剥脱术,术后继续给药,于不同时间处死大鼠后检测各指标变化。结果和对照组相比,旋覆花素能显著抑制内皮剥脱术后血管新生内膜的增生,降低内皮剥脱术引起的血清C-反应蛋白(CRP)、前列腺素E2(PGE2)、丙二醛(MDA)水平的升高(P<0.05),同时增加总抗氧化能力(TAOC)(P<0.05)。结论旋覆花素通过发挥抗氧化与抗炎作用,减缓了内皮剥脱后血管新生内膜的增厚。

血清饥饿可诱导人血管平滑肌细胞再分化

体外培养的分化型血管平滑肌细胞 (vascularsmoothmusclecells ,VSMC)以特异性标志基因表达、长梭形外观及对兴奋剂刺激产生收缩反应为其表型特征 .以血清饥饿法培养处于超汇合 (overconfluence)状态的人VSMC ,观察其分化型标志基因表达活性及其与细胞形态特征和收缩反应性之间的关系 ,探讨细胞生存环境对VSMC基因表达及表型的影响 .研究显示 ,生长至超汇合的VSMC由含血清培养转为血清饥饿后 ,收缩蛋白如SMα肌动蛋白 (SMα actin)、SM2 2α、h1 calponin、肌球蛋白重链 (MHC)SM1和SM2亚型的表达活性明显上调 ,证实血清饥饿诱导的收缩蛋白基因表达和血清应答因子 (serumresponsefactor ,SRF)与CArG顺式元件结合活性的增强有关 .同时 ,血清饥饿还可激活参与VSMC分化调节的转录调控因子SmLIM、Gax和分化相关蛋白HRG 1基因的转录 .随着血清饥饿培养时间的延长 ,VSMC逐渐形成多层、束状、成极性排列的形式 ,对兴奋剂刺激产生的收缩反应明显增强 .结果表明 ,超汇合状态的去分化型VSMC脱离血清刺激后 。

细胞外基质促血管平滑肌细胞迁移及β_3整合素和粘着斑激酶表达

目的 :研究细胞外基质 (ECM)蛋白促血管平滑肌细胞 (VSMC)迁移与 β3整合素及粘着斑激酶 (FAK)表达之间的关系。方法 :应用细胞迁移实验观察骨桥蛋白 (OPN)和纤连蛋白 (FN)对VSMC迁移活性的影响 ,利用RT-PCR和Western印迹探讨 β3整合素、FAK和转录因子Gax表达与细胞迁移之间的关系。结果 :VSMC经 1 0、2 0mg/LOPN和 2 0mg/LFN处理后 ,迁移活性分别达对照组的 1 36、1 57和 1 2 6倍 (P <0 0 5)。用相同浓度 (2 0mg/L)OPN和FN刺激细胞 ,随着作用时间延长 ,VSMC迁移距离逐渐增加。Western印迹和RT -PCR结果证实 ,两种基质蛋白促进VSMC迁移与诱导 β3整合素和FAK基因表达及抑制转录因子Gax表达有关。结论 :β3整合素

高血压相关基因hrg-1对血管平滑肌细胞周期蛋白E和P27蛋白表达及细胞增殖的影响

目的 研究hrg 1对血管平滑肌细胞 (VSMC)增殖的抑制作用是否与调节细胞周期调节蛋白 (cyclin)表达活性有关。 方法 采用pcD2 hrg 1真核表达质粒转染体外培养的VSMCs,Westernblot、MTT法、流式细胞术观察该基因过表达对细胞周期蛋白E(cyclinE)、P2 7表达及细胞增殖和细胞周期的影响。结果 转染pcD2 hrg 1后 ,与对照组细胞相比 ,G1期细胞比例上升 ,S期细胞比例下降 ,细胞生长速率明显减慢 ;而转染hrg 1反义RNA表达载体的细胞生长速率明显加快。转染hrg 1 2 4h后cyclinE表达开始降低 ,之后呈持续下降趋势 ;至 72h ,其表达量约为对照组的 1 /2。P2 7的表达则呈上升趋势 ,转染hrg 1 2 4h后 ,其表达活性显著增加 (为对照组的 2 6倍 ) ;转染后 48h达高峰 ,为对照组的 3 3倍 ;在转染后72h仍维持在较高水平。结论 hrg 1通过上调P2

大鼠血管新生内膜形成过程中NF-κB的活化和ICAM-1及COX-2表达的变化

目的:探讨大鼠血管内膜增生过程中NF-κB活化与内膜炎性增生的相互关系。方法:Westernblotting分析血管壁中NF-κB p65、IκBα及其下游炎性基因ICAM-1和COX-2的表达;用免疫沉淀分析检测NF-κB p65的苏氨酸磷酸化。结果:内皮剥脱后,血管总蛋白与核蛋白中p65的含量于术后7 d达峰值;术后21 d下降但仍高于0、1 d组;但胞浆p65含量无明显变化。p65苏氨酸磷酸化水平与NF-κB核转位成负相关关系。IκBα于术后1 d表现出一过性降低,术后14 d开始回升,21 d接近正常组水平;与此相反,ICAM-1和COX-2的表达于内皮剥脱后升高,至14 d时达峰值,21 d时表达量下降但仍高于正常组。结论:血管内皮剥脱诱导的内膜增生过程中伴有持续的NF-κB p65活化和炎性因子的表达。

SM22α对血管平滑肌细胞肌动蛋白聚合和交联的调节

目的:探讨平滑肌22alpha(SM22α)调节血管平滑肌细胞(VSMC)骨架重构的分子机制。方法:血清饥饿法诱导VSMC由合成型转化成收缩型,转染pEGFP-SM22α表达质粒后观察SM22α在细胞中的分布及其与肌动蛋白纤丝(F-actin)的定位关系;应用反义技术封闭内源性SM22α表达,蛋白分步提取和Western blot分析检测敲减SM22α基因表达对肌动蛋白单体G-actin聚合的影响;F-actin体外交联实验观察SM22α对F-actin交联成束的影响。结果:SM22α在细胞中的分布与F-actin相一致;抑制内源性SM22α表达后,细胞中的SMα-actin主要以可溶性单体G-actin形式存在;F-actin体外交联实验结果表明,GST-SM22α蛋白纯品可促进F-actin交联形成粗大、束状的应力纤维,而敲减内源性SM22α的细胞裂解液促进F-actin交联的活性明显降低。结论:SM22α是参与VSMC细胞骨架重构的调节蛋白,不仅可促进G-actin聚合形成F-actin,而且还可加速F-actin交联成束,在VSMC骨架重构过程中起着十分重要的作用。

SM22α对血管平滑肌细胞骨架及收缩功能的影响

SM2 2α(smoothmuscle 2 2alpha,SM2 2α)是血管平滑肌细胞 (vascularsmoothmusclecells,VSMC)的标志蛋白 ,为了探讨该蛋白与VSMC表型和功能的关系 ,利用血清饥饿法诱导VSMC由合成型向收缩型转变 ,用RT PCR对不同表型VSMC的SM2 2α表达活性进行检测 ,并通过转染反义SM2 2α表达载体 ,观察SM2 2α表达对VSMC细胞骨架和收缩功能的影响。结果显示 ,在VSMC由合成型逆转为收缩型的过程中 ,SM2 2α和平滑肌α 肌动蛋白 (smoothmuscleα actin,SMα actin)的表达分别被显著诱导和轻度上调 ,与此同时 ,细胞骨架由稀疏的网格状变成均匀、致密的束状 ,VSMC重新获得收缩功能。用反义SM2 2α抑制该基因表达后 ,血清饥饿诱导的VSMC细胞骨架重构受阻 ,乙酰胆碱刺激引发的细胞收缩消失。结果提示 ,SM2 2α参与VSMC细胞骨架的构成及调节细胞的收缩功能 。

一种改良的肌细胞骨架染色方法

为了观察肌细胞骨架,对传统考马斯亮蓝染色法进行改良,并与免疫荧光染色法进行了比较。培养的血管平滑肌细胞先用多聚甲醛预固定后再进行考马斯亮蓝染色,可使细胞骨架非常清晰的显色,解决了传统考马斯亮蓝染色易使肌细胞变形、脱片的问题,其效果与免疫荧光染色相近。因此,多聚甲醛预固定-考马斯亮蓝染色法是一种适于肌细胞骨架染色的简便方法。

整合素β_3-粘着斑激酶信号途径的活化参与大鼠血管新生内膜的形成

目的:观察整合素β3-粘着斑激酶(FAK)等信号分子表达和活化与血管新生内膜形成之间的关系。方法:用球囊剥脱法制备血管狭窄模型;用W estern印迹和免疫组化染色检测骨桥蛋白(OPN)、整合素β3和FAK等信号分子的蛋白水平及活化程度。结果:血管内皮剥脱后,OPN、整合素β3和FAK蛋白水平均在血管内皮剥脱后3 d明显增加;术后7 d时达高峰,其中升高的FAK以磷酸化形式为主;14-21 d时,有所回降,但仍高于正常。其表达峰值均出现在血管平滑肌细胞向内膜快速迁移和增殖期,而且伴有细胞外基质降解加快。结论:细胞迁移是一个细胞和细胞外基质相互作用的复杂过程,整合素β3-FAK信号途径在维系该过程的协调统一方面具有重要作用。

重组SM22α C端肽段促进细胞骨架重构

目的:探讨SM22αC端功能域肽段与细胞骨架F-actin聚合的关系,明确SM22α在血管平滑肌细胞(VSMC)骨架重构中的作用。方法:构建GST-SM22αC端功能域融合蛋白原核表达质粒pGEX3X-SM22α,诱导E coli高效表达可溶性GST-SM22α融合蛋白,制备抗SM22α抗体,VSMC蛋白分步提取及Western blot检测F-actin/G-actin中SM22α的含量变化,GST-pull down分析和免疫共沉淀检测SM22α与actin的相互作用,细胞免疫双荧光染色观察SM22α和actin在VSMC中的定位关系。结果:所构建的pGEX3X-SM22α原核表达质粒,在0.5mmol/LIPTG,30℃诱导6h条件下,表达可溶性GST-SM22α融合蛋白的水平最高,用纯化的融合蛋白免疫新西兰白兔获得的抗血清效价为1∶16。免疫双荧光染色和蛋白分步提取分析结果表明,在VSMC再分析过程中,SM22α与F-actin共定位,GSTpull down分析和免疫共沉淀结果均显示,SM22α通过C端功能域与F-actin相互作用而参与细胞骨架的重构;但是,SM22α与G-actin的结合能力较弱。结论:本研究重组得到的SM22αC端功能域具有与F-actin结合的活性,SM22α通过该区域与actin相互作用而参与细胞骨架重构。

hhlim对心肌肥大的影响及其作用机制探讨

hhlim是从胎儿心脏中新近分离和克隆得到的与心脏发生相关的基因 ,其表达产物作为转录因子参与多种基因的转录调控和细胞的发育与分化过程 .用细胞转染方法将外源性hhlim基因导入原代心肌细胞 ,发现该基因强制性表达可使心肌细胞体积明显增大 .RT PCR和蛋白质印迹结果表明 ,hhlim促心肌细胞肥大与诱导α 肌动蛋白 (α actin)过表达及重新启动胚胎期表达基因脑钠肽 (BNP)表达有关 .用可表达hhlim反义RNA的真核表达载体转染心肌细胞后 ,致心肌细胞肥大因子ET 1对BNP和α actin表达的诱导受到显著抑制 .这些结果表明 ,ET 1促进BNP和α actin表达及引发心肌肥大的效应可能由hhlim所介导 ,提示hhlim表达与心肌细胞肥大的启动有关 .单独或共转染转录因子hhlim、Nkx2 5、GATA 4表达质粒和BNP转录调控区指导的报告基因结果显示 ,hhlim强制性表达不仅能直接激活BNP基因表达 ,而且与NKx2 5具有协同作用 .结果表明 ,hhlim可以通过直接或与Nkx2

NF-κB及其抑制蛋白I-κBα与大肠癌侵袭和转移的相关性

目的探讨NF-κB和I-κBα在大肠癌中的表达特点、相互关系及其与大肠癌进展的相关性。方法免疫组化和Western印迹方法检测48例大肠癌患者手术切除的癌组织以及配对的癌旁正常组织标本中NF-κB,I-κBα和p-IκBα的表达情况,分析这3种蛋白的表达与大肠癌侵袭和转移的相关性。结果大肠癌组织中NF-κB的表达水平明显高于正常组织(P<0.01),且随着肿瘤Dukes分期的进展,NF-κB的表达水平呈逐渐升高趋势。大肠癌组织中I-κBα的表达水平明显低于正常组织(P<0.01),且随着肿瘤Dukes分期的进展,I-κBα的表达水平呈逐渐降低趋势,同时,I-κBα的磷酸化(p-IκBα)水平逐渐升高。结论在大肠癌组织中I-κBα的磷酸化降解与NF-κB表达升高有助于肿瘤的进展和不良预后。

在线推扫富集-胶束电动毛细管色谱检测旋覆花素中和大鼠血浆中的旋覆花内酯

采用熔融石英毛细管,以含有50mm o l/L十二烷基硫酸钠的50mm o l/L硼酸盐缓冲液为电极缓冲液,以10mm o l/L硼酸盐缓冲液为上样缓冲液,经过对分离条件的优化,成功地建立了胶束电动毛细管色谱结合在线sw eep ing(推扫)富集技术检测中性脂溶性物质旋覆花内酯(acety lb ritann ilac tone,ABL)的实验方法。所建方法的批内、批间测定值的相对标准偏差均小于5%,灵敏度为0.005g/L,回收率大于92%;被检测样品的含量与峰面积呈良好的线性关系,相关系数为0.997 5。用所建立的方法检测了旋覆花素中ABL的含量及其在体内的动态变化,结果表明胶束电动毛细管色谱结合在线sw eep ing样品富集技术可显著提高检测的灵敏度。该方法具有操作简单、进样量小(nL级)、检测速度快等特点,弥补了毛细管电泳在测定痕量组分方面的不足。

JAK-STAT参与血管平滑肌细胞血管紧张素原和心钠素基因的转录激活

为探讨Janus蛋白酪氨酸激酶2-转导及转录激活因子5(JAK2-STAT5)途径在介导血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)诱导的血管平滑肌细胞(VSMC)血管舒-缩肽表达调节的作用及分子机制,以AngⅡ为诱发因素刺激培养的大鼠VSMC,用免疫共沉淀、Western印迹分析和激光共聚焦显微镜观察STAT5磷酸化及其核转位,用电泳迁移率改变分析(EMSA)确定STAT5与血管活性肽基因调控区顺式调控元件的结合活性.结果显示,STAT5磷酸化水平分别于AngⅡ刺激10 min和12 h出现两个高峰,增加的磷酸化STAT5主要分布在细胞核内.AngⅡ诱导的STAT5活化与核转位可被JAK2的特异抑制剂AG490所抑制.EMSA结果显示,用AngⅡ刺激VSMC后,核蛋白与含有血管紧张素原基因启动子STAT5识别序列的探针结合活性显著升高;而核蛋白与含有心钠素(ANF)基因启动子STAT5识别序列的探针结合活性则呈下降趋势,核蛋白与两种探针的结合活性均可被JAK2抑制剂AG490所消除,并且加入抗STAT5抗体后均可出现滞后的超迁移带.结果提示,AngⅡ通过激活JAK2-STAT5介导信号向胞核内传递,STAT5与相应的顺式元件结合是启动血管紧张素原和心钠素基因表达所必需的转录调控机制之一.

无胶筛分毛细管电泳法检测微量蛋白质骨桥蛋白

采用非涂层毛细管,以150mm o l/L硼酸盐缓冲液为电泳缓冲液,30g/L聚乙二醇(PEG)20000为筛分介质,经对分离条件进行优化,成功地建立了用无胶筛分毛细管电泳检测微量蛋白质的方法。用所建立的方法测定骨桥蛋白,其批内、批间迁移时间的相对标准偏差均小于5%,回收率大于95%,被检测样品中骨桥蛋白的含量与其峰面积呈良好的线性关系(相关系数为0.996),最低检测限为0.079g/L。考察了无血清饥饿培养对血管平滑肌细胞分泌骨桥蛋白的影响,结果表明无血清饥饿培养24h骨桥蛋白的合成与分泌达到高峰,此后随时间延长含量随之降低,此结果与采用W estern b lo t方法检测的结果一致。该方法具有进样量小(nL级)、检测速度快、可自动化等优点,是一种简便、快捷的检测微量蛋白质的好方法。

细胞肥大过程中hhLIM的亚细胞定位变化及其对细胞骨架的影响

hhlim (humanheartlim)是从人胎心cDNA文库中筛选克隆的一个新基因 ,作为LIM家族的新成员参与心肌肥大的发生发展过程 .为了进一步研究hhLIM在心肌肥大发生过程中的作用 ,以C2C12细胞为研究对象 ,以心肌肥大强效刺激因子内皮素 1(ET 1)为诱导因素 ,探讨hhLIM与肌动蛋白的相互作用及其影响细胞骨架的分子机制 .RT PCR、Western印迹和细胞免疫荧光分析结果表明 ,心肌肥大刺激因子ET 1在诱导心肌肥大标志基因BNP和肌动蛋白表达的同时 ,使hhLIM蛋白在C2C12细胞胞核与胞质之间进行重新定位 .激光共聚焦显微镜观察结果显示 ,hhLIM与肌动蛋白在胞质中共定位 .蛋白分步提取、鉴定及hhLIM与F肌动蛋白结合与沉降实验证明 ,hhLIM多存在于细胞骨架及其相关蛋白部分 ,在体外可与F肌动蛋白共结合 .这些结果表明 ,胞质中的hhLIM作为细胞骨架相关蛋白与肌动蛋白相互作用 .进一步研究hhLIM与细胞骨架的关系时发现 ,hhLIM过表达可使C2C12细胞的骨架变成致密网状纤维并使其对细胞松弛素导致的细胞骨架解聚产生一定的抵抗作用 ,抑制hhLIM表达则使细胞骨架稀疏 ,结构模糊 .提示hhLIM参与细胞骨架组织及重构的机制与其结合并稳定F肌动蛋白有关 .

AP-1在AngⅡ正反馈调节其前体基因表达中的作用

血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)可诱导其前体基因在血管平滑肌细胞(vascularsmoothmusclecells,VSMC)中进行表达,其作用机制与促进转录激活蛋白-1(activatingprotein-1,AP-1)的基因调控区中存在的AP-1位点结合有关.为进一步明确AngⅡ调节AP-1结合活性的分子机制,用放线菌酮(cycloheximide,CHX)作为c-Jun磷酸化抑制剂,经DNA-蛋白质相互作用和蛋白质印迹实验,探讨AngⅡ对AP-1结合活性的影响并探讨其分子机制.结果表明,受AngⅡ刺激的VSMC,其核蛋白中AP-1的组成亚基之一c-Jun水平明显升高.免疫细胞化学染色显示,在被AngⅡ处理的细胞中,c-Jun主要定位于细胞核,胞浆中几乎检测不出该转录激活蛋白的存在.用丝氨酸磷酸化抗体检测证实,AngⅡ可诱导c-Jun磷酸化.电泳迁移率改变分析(electrophoreticmobilityshiftassay,EMSA)显示,c-Jun的磷酸化水平与AP-1结合血管紧张素原基因顺式元件的活性,和对该基因的转录激活作用呈正相关关系,CHX通过阻断c-Jun磷酸化抑制AngⅡ诱导的AP-1结合活性,但是不影响c-Jun的表达水平.上述结果提示,AP-1的磷酸化活化是AngⅡ正反馈调节其前体基因表达的重要机制之一,首次发现CHX是c-Jun磷酸化的抑制剂.