拟血管性痴呆小鼠模型皮层及海马细胞病理组织学动态观察

目的 :观察拟血管性痴呆小鼠模型大脑皮层及海马细胞病理形态学的较长期演变。方法 :复制拟血管性痴呆小鼠模型 ,分别于术后 7d、15d、30d脑部取材 ,石蜡切片 ,HE与Nissl染色 ,对皮层及海马细胞病理形态学进行较长期动态观察。结果 :7d模型小鼠大脑皮质变薄 ,部分神经细胞核固缩 ,局限性神经元数目减少 ,出现筛网状结构 ,胶质细胞增生 ,15d、30d镜下与 7d基本相同。海马CA1区细胞脱失 ,随时间推移逐渐加重 ,至术后 30d ,海马CA1区细胞几乎完全脱失 ,胶质细胞大量增生 ,形成结节 ,CA2 、CA3 区细胞也严重脱失 ,呈现海马硬化。结论 :海马锥体细胞的迟发性坏死是缺血性脑血管病致痴呆的病理学基础。

CC-K8抑制LPS诱导的大鼠肺间质巨噬细胞TLR4及IL-1β的表达

目的观察八肽胆囊收缩素(cholecystokininoctapeptide ,CCK 8)对外源性脂多糖(lipopolysaccharide ,LPS)激活大鼠肺间质巨噬细胞(pulmonaryinterstitialmacrophages,PIMs)Toll样受体4 (Tolllikereceptor4 ,TLR4 )及IL 1β表达的影响,探讨CCK- 8的抗炎作用机制。方法分离培养大鼠PIMs ,经LPS、CCK- 8及溶剂单独或共同孵育不同时间后,采用Northernblot、ELISA、RT PCR技术检测TLR4mRNA、IL- 1β及IL- 1βmRNA表达的变化。结果LPS(1mg/L)刺激可使PIMs中TLR4mRNA表达明显增强;随着LPS孵育时间的延长,细胞中的IL -1β含量逐渐增多,2 4h达高峰,IL- 1βmRNA表达水平同时明显升高;CCK 8可剂量依赖性抑制LPS诱导的大鼠PIMsTLR4mRNA、IL- 1β及IL 1βmRNA的表达。结论CCK 8对LPS激活的PIMsTLR4及IL- 1β表达有负性调节作用,是CCK- 8抗炎作用机制之一。

CCK-8降低TNF-α诱导的大鼠RSC-364细胞增殖及p38 MAPK活性

目的 观察硫酸化八肽胆囊收缩素（CCK-8）对TNF-α诱导大鼠成纤维样滑膜细胞株RSC-364细胞增殖及丝裂原活化蛋白激酶p38（p38 MAPK）活性的影响.方法 采用噻唑蓝（MTT）比色法检测细胞增殖;Western blot技术检测p38 MAPK活性.结果TNF-α（50 μg/L）孵育5 min,p38 MAPK磷酸化水平升高,15 min达高峰,2 h恢复基础水平;孵育15 min时,p38 MAPK磷酸化程度随其剂量（10、25、50 μg/L）的增大而增加.CCK-8（10^-10～10^-6 mol/L）剂量依赖性降低TNF-α诱导的细胞增殖及磷酸化p38 MAPK的激活,此作用可被CR1409和CR2945拮抗.SB203580（10 μmol/L）可抑制TNF-α引起的细胞增殖.结论 CCK-8通过降低p38 MAPK磷酸化水平而抑制TNF-α激活的RSC-364细胞增殖,该作用可能由CCK-A和CCK-B受体共同介导.

纤溶酶原激活物抑制剂1 siRNA对大鼠肺纤维化的治疗作用

目的:观察纤溶酶原激活物抑制剂1(PAI-1)siRNA对博来霉素(BLM)诱导的大鼠肺纤维化的治疗作用,并初步探讨其机制。方法:72只Wister大鼠分为4组,即对照组(control组)、BLM组、BLM+非特异siR-NA组(BLM+N组)和BLM+PAI-1 siRNA组(BLM+P组)。BLM 5 mg/kg气管内滴入制作肺纤维化模型,control组注入等体积的生理盐水。造模后,于局麻下BLM+P组每周2次气管内注入PAI-1 siRNA 7.5 nmol(0.2 mL);BLM+N组注入相同剂量的非特异siRNA;control组和BLM组注入等体积的生理盐水,28 d共给药8次。分别于第7 d、14 d和28 d每组处死6只,左肺行肺泡灌洗测定PAI-1活性,右中叶肺组织RT-PCR法检测Ⅲ型胶原、α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)和金属蛋白酶组织抑制物1(TIMP-1)的mRNA表达。结果:造模后,7 d、14 d和28 d肺泡灌洗液中PAI-1活性持续升高,每周2次气管内注入PAI-1 siRNA可以使肺泡灌洗液中PAI-1的活性降低,与同一时点BLM组比较有明显差异(均P<0.05);模型组7 d、14 d和28 dⅢ型胶原、α-SMA和TIMP-1的mRNA表达明显增高,BLM+P组3个时点Ⅲ型胶原、α-SMA和TIMP-1的mRNA表达明显减少,分别与同一时点BLM组比较有明显差异(均P<0.05)。结论:每周2次气管内给予PAI-1 siRNA可以持续减少PAI-1表达。PAI-1 siRNA不但直接抑制肺纤维化进展,而且可以打破基质金属蛋白酶及组织抑制因子之间的平衡。

乙型肝炎病毒e抗原阴性慢性乙型肝炎与前C基因及C基因变异关联性临床研究

目的临床观察乙型肝炎病毒e抗原(HBeAg)阴性的慢性乙型肝炎(e-CHB)与前C基因及C基因变异的关联性。方法将慢性乙型肝炎193例进行血清HBeAg、乙型肝炎病毒脱氧核糖核酸(HBV-DNA)水平、前C基因核苷酸1896G→A点突变及C基因核苷酸1762碱基A→T和1764G→A联合突变的检测。结果慢性乙型肝炎193例中,①HBeAg阴性70例(36.27%),HBeAg阳性123名(63.73%)。②HBeAg阴性前C基因变异率76%,HBeAg阳性前C基因变异率31%,二者比较差异有统计学意义(P<0.05);HBeAg阴性C基因变异率51%,HBeAg阳性C基因变异率30%,二者比较差异无统计学意义(P>0.05)。③HBeAg阳性患者中,前C基因或C基因变异群的HBV-DNA水平低于未变异群,差异比较有统计学意义(P<0.05),而HBeAg阴性患者中,前C基因或C基因变异群与非变异群比较,血清HBV-DNA水平差异比较均无统计学意义(P>0.05)。结论在e-CHB中,前C基因变异与HBeAg转阴具有密切关系,而C基因变异与HBeAg转阴关系不明确;前C基因和C基因变异不能增强病毒毒性,与疾病严重程度可能无关。

肢体缺血-再灌注大鼠脑组织iNOS基因表达的半定量检测

目的 检测大鼠肢体缺血 再灌注后脑组织iNOS基因表达的变化。方法 SD大鼠 ,随机分为肢体缺血 再灌注 (I R)组、肢体单纯缺血 (I)组及正常对照 (N)组 ,通过夹闭腹主动脉末端 4h ,或 和开放 2～ 2 4h ,复制I、I R组动物模型 ,半定量RT PCR方法检测脑组织iNOSmRNA表达的变化 ,免疫组化染色法观测脑组织内iNOS及过氧亚硝基阴离子 (ONOO- )的硝基化产物硝基酪氨酸 (NT)的生成与分布。结果 N组脑组织iNOSmRNA未检出 ,I组及I R组脑组织iNOSmRNA均有表达 ,再灌注 2h ,iNOSmRNA表达量显著升高 (P <0 .0 1,vsN组 ) ,再灌注 6h达到高峰 ,随后下降 ,2 4h仍有少量表达 ;I及I R组脑组织均有iNOS阳性细胞 ,I R组见于大脑皮层各区、海马、尾状核 ,I组仅见于皮层后肢区及尾状核。I R组脑组织可见弥散分布的NT阳性神经元 ,I组偶见NT阳性神经元。结论 大鼠肢体缺血 再灌后脑组织iNOS基因表达显著增强 。

纤维溶解酶原激活物抑制剂-1对大鼠胚肺成纤维细胞的影响

目的 研究纤维溶解酶原激活物抑制剂-1（PAI-1）对大鼠胚肺成纤维细胞增殖、转化及胶原合成的影响,探讨PAI-1在肺纤维化发生中的作用.方法 体外分离培养Wister 待产孕大鼠胚肺成纤维细胞,应用四甲基偶氮唑盐试验观察不同浓度（5、10、20、40、80 μg/L）的PAI-1刺激12、24和48 h后成纤维细胞的增殖率;选用PAI-1最适浓度20 μg/L刺激48和72 h后,细胞免疫化学法检测增殖细胞核抗原（PCNA）的表达;实时PCR法检测α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）、Ⅰ型胶原24和48 h时mRNA表达的变化.结果各浓度PAI-1刺激成纤维细胞后,以20 μg/L 12 h增殖率及吸光度值最高,分别为62.6%和0.573±0.039.在12 h中,不同浓度组较对照组差异有统计学意义（F=111.112,P=0.000）,选择20 μg/L为最适浓度.免疫细胞化学法检测20 μg/L PAI-1刺激48、72 h后,PCNA表达的积分吸光度值分别为3685±686和2530±477,较对照组差异有统计学意义（F=7.85,P=0.020）.PAI-1刺激成纤维细胞24和48 h后,α-SMA表达上调（230±11）%和（159±9）%,较对照组差异有统计学意义（F=39.92,P=0.000）.Ⅰ型胶原表达上调（92±8）%和（65±12）%,差异有统计学意义（F=32.61,P=0.001）.结论 PAI-1可以促进成纤维细胞增殖、转化及胶原合成,可能促进肺间质纤维化的发生和发展.

纤溶酶原激活物抑制剂-1在罗格列酮抑制成纤维细胞转化及胶原合成中的作用

目的 观察纤溶酶原激活物抑制剂-1（PAI-1）在罗格列酮抑制大鼠胚肺成纤维细胞转化及胶原合成中的作用及信号机制.方法 大鼠胚肺成纤维细胞分为3组：罗格列酮组加入罗格列酮30 mmol/L,PAI-1组加入罗格列酮30 mmol/L及PAI-1 20 mmol/L,对照组加入等量的培养基,分别于24、48和72 h收取细胞,离心后-80℃冻存备用.采用RT-PCR法检测成纤维细胞24hⅠ型胶原、Ⅲ型胶原mRNA的表达;Western blot技术分析3个时间点PAI-1,α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）、p-AKT和p-ERK的表达.结果 24、48和72 h罗格列酮组成纤维细胞PAI-1的蛋白表达（0.732±0.015、0.583±0.005、0.762±0.032）较对照组（1.116 ±0.046）明显减低,PAI-1组（0.923 ±0.042、1.024±0.009、1.070±0.011）较罗格列酮组明显增加,差异均有明显统计学意义（F=78.609,均P＜0.01）.24、48和72 h罗格列酮组α-SMA的蛋白表达（0.209±0.012、0.280±0.140、0.254±0.025）较对照组（0.340 ±0.026）明显降低,PAI-1组（0.386 ±0.042、0.400±0.037、0.385±0.026）均较罗格列酮组明显增加（F=35.009,均P＜0.01）.罗格列酮组肺成纤维细胞Ⅰ型胶原（1.065±0.004）和Ⅲ型胶原（1.282±0.001）的mRNA含量较对照组（1.279 ±0.013、1.690±0.005）明显减低,而PAI-1组（1.390 ±0.029、1.350 ±0.044）较罗格列酮组明显增加（F=12.429、127.456,均P＜0.01）.24、48和72 h p-AKT的蛋白含量在3组间无明显改变（F=2.736,P＞0.05）,p-ERK的表达在PAI-1组（0.561 ±0.101、0.448±0.022、0.406 ±0.003）、罗格列酮组（0.288±0.010、0.311±0.034、0.336±0.038）和对照组（0.506±0.032）间差异有统计学意义（F=153.548,P＜0.01）.结论 罗格列酮可以抑制大鼠胚肺成纤维细胞PAI-1的表达,活化纤溶系统.上调PAI-1表达后,罗格列酮抑制大鼠胚肺成纤维细胞向肌成纤维细胞转化及胶原合成的能力减弱.罗格列酮对成纤维细胞的调节作用可能是通过PAI-1与ERK信号途径之间的相互作用实现的.

纤溶酶原激活物抑制剂-1对大鼠肺成纤维细胞凋亡的影响

特发性肺纤维化（Idiopathic pulmonary fibrosis，IPF）以成纤维细胞转化为肌成纤维细胞及细胞外基质（ECM）过度沉积”剖为特征，减少ECM沉积、促进肺损伤过程中成纤维细胞／肌成纤维细胞的及时凋亡有望成为治疗肺纤维化的有力措施。近年来，人们通过转基因鼠的实验发现了纤溶酶原激活物抑制剂-1（PAI-1）在肺纤维化发病中的作用。本研究中我们观察了PAl-1对大鼠胚肺成纤维细胞自发凋亡及抗Fas抗体诱导凋亡的影响及信号机制，进一步说明PAI-1在IPF发病中的作用。