猪瘟病毒强毒株SYBR Green Ⅰ实时荧光定量PCR检测方法的建立

为准确快速诊断猪瘟病毒(classical swine fever virus,简称CSFV)强毒,对GenBank已公布的CSFV的基因组全序列进行分析,根据CSFV-5'NTR核苷酸序列设计1对特异的荧光定量引物,建立快速检测猪瘟病毒强毒株SYBR Green-Ⅰ实时荧光定量PCR方法。结果表明,该法具有很好的敏感性,对猪瘟病毒最低检出量为10拷贝/μL;特异性强,与猪瘟兔化弱毒苗、伪狂犬病毒(简称PRV)、猪细小病毒(简称PPV)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(简称PRRSV)、圆环病毒组织苗(简称PCV2)没有交叉反应;重复性好,变异系数(CV)为0.47%~1.36%。该方法可用于猪瘟病毒的快速检测。

基于几丁质酶基因序列分析鉴定兔源须癣毛癣菌

利用几丁质酶基因(CHS1)序列分析和形态学方法对兔源须癣毛癣菌分离株(31株)进行鉴定和分型。从患兔采集病料,在沙保弱培养基进行分离培养,观察菌落和菌丝、孢子的形态及尿素酶、毛发穿孔等生理试验表现;提取病料和分离株DNA,扩增目的基因,通过序列分析,结合形态学方法对分离株进行鉴定,根据分离株序列同源性差异进行基因分型。结果显示,分离株的菌落多数为颗粒型和粉末型,占87.09%(27/31),背面有黄褐色素沉着,有大量葡萄状小分生孢子、螺旋菌丝、梳状菌丝及棒状大分生孢子,尿素酶试验和毛发穿孔试验阳性;CHS1序列比对显示分离菌株与须癣毛癣菌复合体的指间须癣毛癣菌有99.2%~95.4%相似性。根据CHS1序列比对结果,结合分离株的形态学特征,将该菌株鉴定为亲动物指间须癣毛癣菌。基于CHS1序列同源性差异,将分离株分成5种基因类型,其中Ⅰ型和Ⅱ型是优势菌株,占54.84%(17/31),提示CHS1序列分析可以用于须癣毛癣菌的鉴定和基因分型。

兔须癣毛癣菌的分离与鉴定

利用rDNA ITS序列分析结合真菌形态学和生理学对兔的病原菌进行鉴定。提取菌株DNA,利用引物ITS1和ITS4进行PCR扩增,扩增产物测序后在GenBank核酸数据库中进行同源性比对。结果显示,分离株的菌落形态为白色粉末状,背面有色素沉着,培养可见大量葡萄状小分生孢子,螺旋菌丝及棒状大分生孢子;尿素酶和毛发穿孔试验阳性;rDNA序列比对结果显示,该分离菌株与须癣毛癣菌复合体中的万博节皮菌有99.8%同源性;从形态学和生理学试验符合须癣毛癣菌的特点,结合分子生物学试验将该菌株鉴定为万博节皮菌。

兔须癣毛癣菌感染样本常规诊断与定量PCR诊断的比较研究

目的为探讨须癣毛癣菌快速、敏感、特异的诊断方法。方法采集患兔临床样本63例,分别进行培养法、镜检法和定量PCR法诊断,比较这些方法的敏感性、特异性、阳性预测值和阴性预测值。结果显示样本培养法、镜检法和定量PCR法的阳性率分别为65%、73%和86%;与常规方法（培养法和镜检法）相比,定量PCR法敏感性和阴性预测值均为100%,高于培养法（77.35%和45.45%）和镜检法（86.79%和64.17%）,而特异性（90.90%对100%～100%）和阳性预测值（90.90%对100%～100%）两种方法无明显差异。结论培养法特异,但敏感性差、耗时长,有假阴性;镜检快速,但不特异,敏感性低;而定量PCR快速、敏感、又特异,可以替代镜检用于临床样品的诊断,但不能替代培养法。

兔须癣毛癣菌分类研究进展

须癣毛癣菌可引起兔皮肤真菌病,也是人兽共患病的病原。近年来,研究证明须癣毛癣菌为复合体,因此,对其进行正确分类,准确的鉴定,在兔皮肤真菌病控制和公共卫生方面均具有重要意义。对于须癣毛癣菌的鉴定,过去主要以形态学和配对试验为主,随着分子生物学的发展,现在开始采用基因序列比对的方法,较理想的方法是形态学和分子生物学相结合。

河北兔场皮肤病原真菌rDNA-ITS序列分析

利用皮肤真菌核糖体内转录间隔区(ITS)序列通用引物,对采自河北省兔场的5种皮肤真菌病进行了PCR扩增,ITS区的克隆、测序、序列变异及遗传进化关系分析。经与GenBank核酸序列数据库数据比对和形态学观察结果表明:有4种真菌被鉴定,分别为须毛癣菌、多聚曲霉、球孢白僵菌和产黄青霉,1种未鉴定;不同病原菌的5.8SrDNA序列高度保守,而ITS区的变异性则较高。该研究确定ITS区序列分析可用于兔皮肤病原真菌的分离。

家兔须癣毛癣菌感染快速诊断方法的建立

为探讨兔须癣毛癣菌感染快速诊断方法，对55例临床病例样品分别通过KOH显微检查、体外分离培养和巢式PCR技术检查，比较其阳性率。结果发现单纯KOH显微检查阳性率为52．7％（29／55），改良KOH显微镜检阳性率为72．7％（40／55），体外分离培养阳性率为80．09／6（44／55），第1轮PCR检测阳性率为50．9％（28／55），巢式PCR检测的阳性率为85．5％（47／55）。KOH镜检简单快速（20～30min），但缺乏特异性和敏感性，有假阴性结果。体外分离培养虽具有特异性，但确诊所需时间长（4～6周）。巢式PCR技术速度快（6-8h）、特异性强、敏感性高，不受人为因素和培养条件的影响，是较理想的须癣毛癣菌感染快速诊断方法。

家兔须癣毛癣菌SYBR GreenⅠ荧光定量PCR检测方法的建立及初步应用

为建立家兔须癣毛癣菌快速检测方法,根据GenBank上已发表的须癣毛癣菌rDNA内转录间隔区核苷酸序列设计了1对特异性引物,建立了检测须癣毛癣菌SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR方法,并用该方法对临床分离的须癣毛癣菌和病料进行检测。结果显示,该方法灵敏度高,对须癣毛癣菌的最低检出量为10copies/μL;特异性强,与犬小孢子菌、絮状表皮癣、红毛癣菌、白色念珠菌、烟曲霉等病原真菌没有交叉反应。该方法操作简单,耗时短,只需2h即可完成整个试验过程。提示该方法可用于须癣毛癣菌的检测。

兔万博节皮菌的分离鉴定

利用r DNA ITS序列分析,结合真菌形态学对兔的病原菌进行了鉴定。采集疑似患皮肤真菌兔的皮屑、结痂和被毛等病料,在沙保弱培养基分离培养;用分离菌株进行动物回归试验;提取分离菌株DNA,采用引物ITS1和ITS4进行PCR扩增,扩增产物测序后在Gen Bank核酸数据库中进行同源性比对。结果显示,共分离出29株真菌,其菌落为颗粒状、背面有褐色色素沉着;显微镜下小分生孢子为葡萄状,大分生孢子为棒状,菌丝为螺旋状;病理组织切片显示,病变部位皮肤充血、毛囊内有孢子样菌丝段;r DNA序列比对结果显示,分离菌株与须癣毛癣菌复合体的万博节皮菌有98.6%-95.0%的同源性。根据ITS区序列比对结果,结合菌落的形态学特征和兔皮肤病理变化,证明所分离的菌株为万博节皮菌。

鸡传染性支气管炎病毒与白色念珠菌混合感染的诊断及病原分离鉴定

为了掌握发病鸡场的致病原及致病原的生物学特性,试验采用临床和实验室诊断、病原分离与鉴定等方法对临床疑似鸡传染性支气管炎病毒和念珠菌混合感染病例进行了研究。结果表明:临床组织病料经革兰氏染色镜检可见革兰氏阳性、圆形或卵圆形的酵母样细胞,经传染性支气管炎病毒和念珠菌特异性检测引物检测均为阳性;临床病料接种土豆琼脂培养基上可见圆形、乳白色、背面没有色素沉着的单个菌落,分离菌株革兰氏染色可见革兰氏阳性、菌体大小不一、圆形或椭圆形的酵母样菌,在玉米粉吐温培养基上可见厚膜孢子,在羊血清培养基上可见芽管,分离菌株的ITS基因与Gen Bank中白色念珠菌同源性高达97.4%;临床病料接种SPF鸡胚可呈现典型的"侏儒胚"现象,分离病毒的S1基因与Gen Bank中鸡传染性支气管炎病毒同源性高达99.7%。说明发病鸡场由鸡传染性支气管炎病毒和念珠菌混合感染所致。

邯郸地区鸡白痢沙门氏菌的分离鉴定与耐药性分析

为了掌握邯郸地区鸡白痢沙门氏菌的流行情况和耐药情况,试验采用病原菌分离、形态学观察、生化试验、序列分析、药敏试验等方法对邯郸地区疑似沙门氏菌感染的病鸡进行了研究。结果表明:共分离鉴定出48株鸡白痢沙门氏菌,48株分离菌株对氟苯尼考、氯霉素、恩诺沙星、诺氟沙星、氧氟沙星、卡那霉素、环丙沙星、阿米卡星、头孢噻呋、头孢噻肟、大观霉素、链霉素、庆大霉素、新霉素较敏感,敏感率分别为97.92%、93.75%、93.75%、89.58%、87.50%、87.50%、85.42%、85.42%、85.42%、83.33%、83.33%、87.50%、83.33%、83.33%,对四环素、多西环素、磺胺嘧啶、磺胺甲口恶唑、磺胺异口恶唑、氨苄西林、阿莫西林的耐药性较强,耐药率分别为100%、97.92%、91.67%、87.50%、85.42%、56.25%、52.08%,48株分离菌株均具有多重耐药性,其中以5重耐药和7重耐药为主,分别占33.33%和39.58%。说明邯郸地区鸡白痢沙门氏菌的感染率较高,且具有不同程度的耐药性。

鸡白痢沙门菌外膜蛋白C的原核表达与免疫反应性分析

利用PCR方法扩增鸡白痢沙门菌主要抗原外膜蛋白C的基因,将其定向克隆至pET30a(+)原核表达载体,转化大肠杆菌BL21表达菌,利用His标签的蛋白纯化柱纯化重组蛋白,通过免疫印迹检测重组蛋白活性。通过BamHⅠ/HindⅢ双酶切鉴定获得了pET30a-C原核表达重组质粒,转化BL21表达菌后,通过IPTG诱导获得以包涵体形式存在的重组蛋白,重组蛋白纯化后免疫印迹检测显示具有良好的反应原性。本研究为鸡白痢基因工程抗原的制备及诊断试剂研究奠定了基础。