枣疯病和泡桐丛枝病原植原体分离物的组织培养保藏和嫁接传染研究

分别从河北唐县赞皇大枣、辽宁凌源梨枣和河南濮阳扁核酸3个品种的枣疯病和来自山东、江西和北京的不同无性系的泡桐丛枝病树上采集丛枝枝条作为组织培养材料,获得的枣疯病和泡桐丛枝病组培苗皆表现典型的丛枝症状。其中感染植原体的赞皇大枣组培苗(Ft)和扁核酸组培苗(HPD)在未加任何激素的MS培养基和其它培养基交替继代培养1a以上仍能维持丛枝苗生长;而发病梨枣(LD)除产生丛枝外,还出现叶片黄化和植株矮化、枯梢等衰退症状。泡桐丛枝病植原体可在不同无性系组培苗上通过各种培养基交替和单纯的MS培养基继代培养,并已在实验室内连续保藏达10a,其引致丛枝症状的能力无明显的改变。用枣树Ft染病材料作接穗,以健康冬枣(DJ)和抗病婆枣(W14)砧木进行组培苗间嫁接传病试验,可使部分DJ和W14发病;而嫁接未发病的砧木多数像健苗一样正常生长。用感染山东泡桐丛枝病植原体ZD株系丛枝组培苗为接穗,嫁接健康泡桐无性系组培苗致使无性系MB33、TY2T和C125发病。用植原体16SrDNA通用引物进行PCR,确证了泡桐和枣树发病苗和嫁接发病组培苗体内存在植原体。用DAPI荧光显微镜技术比较组培苗韧皮部筛管中的植原体浓度,结果显示,Ft和嫁接发病冬枣(DJ Ft)筛管中植原体浓度相对较高,但仍低于各泡桐无性系染病丛枝组培苗;

几个枣树品种和婆枣单株对枣疯病抗性的鉴定

通过嫁接病皮和病枝传病的方法,在河北唐县试验地内对壶瓶枣、蛤蟆枣、婆枣、马牙枣、砘子枣、长红枣6个枣树品种和1个酸枣品种,以及从婆枣中选择的4 6个抗性单株的抗病性进行试验研究。经过1 996年以来的多次传病测定结果表明:壶瓶枣和蛤蟆枣无一发病,表现出强的抗病性;长红枣、马牙枣、酸枣、婆枣和砘子枣表现为感病,发病率分别为6 6 6 %、78 6 %、80 0 %、1 0 0 %、1 0 0 %。筛选的4 6个婆枣单株的平均发病率为81 1 %,单株间抗病表现差异明显,有4个单株经过6年6次传病而一直没有发病,说明其对枣疯病有很强的抗性,用DAPI荧光显微镜观察,尤其是PCR技术检测,基本上能在嫁接接种后未发病的抗病单株上检测到植原体的存在,说明其体内已携带了低浓度的植原体,暗示抗病材料对植原体繁殖可能有抑制作用。对酚类物质在2个层析系统进行的薄层层析分析中发现某些抗病材料与感病材料存在不同特异性的荧光斑。在对枝条组织切片自发荧光观察中,在抗病的2个婆枣材料和1个壶瓶枣材料的韧皮部至表皮区域的薄壁细胞内中发现了较多的金黄色亮斑点。

中国各地不同枣树品种上枣疯病植原体的PCR检测及分子变异分析

【目的】检测不同地区枣树品种上的枣疯植原体侵染及保守基因序列的变异。【方法】利用植原体16S rDNA的通用引物R16mF2/R16mR1、16S-23S间区序列(SR)的通用引物SR1/SR及secY基因引物FD9f/r,通过PCR检测采自国内7个地区14个枣树品种上的32个枣疯病和4个酸枣丛枝病样品。将PCR产物进行直接或克隆测序,结合已报导的测序数据,进行序列同源性和系统进化分析。【结果】所有枣疯病样品中均检测到植原体;皆属于榆树黄化16SrV-B亚组,与我国重阳木丛枝和樱桃致死黄化遗传关系更近,而与国外的其他植原体亲缘关系较远。不同地区和不同抗性品种上的植原体在16S rDNA、SR和secY基因上都存在程度不同的序列差异。直接测序法检出的优势株系分布范围很广。不同株系间的secY基因变异比16S rDNA和SR更明显,某些碱基替换并不影响编码氨基酸种类,但有的株系的碱基缺失使编码框中断。【结论】不同地区不同品种枣树上枣疯植原体间存在着较为丰富的遗传多样性,与PCR产物直接测序法相比,用克隆测序结果能检测到更多的碱基突变,对于鉴别不同植原体株系及研究其系统发育关系更为有用。

野生酸枣疯病与栽培大枣疯病发生的关系

为了明确野生酸枣疯病与栽培大枣疯病发生和流行的关系,采用随机徒步调查、挖根和接穗嫁接法对我国野生酸枣、栽培大枣及大枣接穗嫁接野生酸枣的枣疯病进行了田间调查,并取样检测病菌及比较不同菌株的保守基因序列。结果显示,我国野生酸枣疯病发生范围广,且地区间自然发病率差异很大,在0～40%之间;病株呈明显的团簇状分布,病菌在团簇中的根蘖苗与母株间传播或通过介体昆虫传播到后代种子苗上。在枣疯病流行区,栽培大枣发病与枣园周围分布的野生酸枣发病程度有关;用感病品系的接穗或带菌接穗嫁接到野生酸枣砧木上易导致嫁接苗发病和病害流行,而采用抗病的壶瓶枣和婆枣抗病品系接穗嫁接野生酸枣则发病率明显下降。用巢式PCR进行的病菌检测结果显示,在病害流行区酸枣或大枣无症状枝叶样品的带菌检出率为10%～32%。不同地区栽培大枣和野生酸枣上植原体的16SrDNA、16S-23SrDNA间区(SR)及核糖体蛋白基因(rp)序列比较鉴定结果显示,侵染酸枣的植原体与栽培大枣疯病植原体应为相互传染的同种致病菌。