微生物发酵技术在中药苷类生物转化中的应用进展

苷类是诸多中药的主要活性成分之一。近年来,因其抗炎、抗病毒、增强免疫、抗癌等药理活性的发现,苷类中药成分越来越受到研究者的重视。绝大多数苷类经肠道微生物发酵转化为苷元或低糖苷等成分发挥药效,为了提高苷类成分的生物利用度,在体外将苷类物质转化为相应活性成分,就成为十分有意义的研究课题。微生物发酵技术因其反应特异性强、副产物少、反应条件温和、清洁环保等优点在中药转化领域具有独特优势,利用微生物对苷类中药进行转化的研究大量涌现。本文对近年来微生物发酵转化中药苷类活性成分的研究进展进行展望。

一株发酵转化黄芩苷菌株的筛选及鉴定

为实现生物发酵法转化黄芩苷生产活性产物黄芩素,本研究从自然发毛的新鲜黄芩植株根部筛选发酵转化黄芩苷生成黄芩素的菌株,并进行产物分析和菌株鉴定。通过马铃薯葡萄糖培养液(PDB)富集,黄芩药粉培养液初筛,马铃薯葡萄糖琼脂(PDA)平板分离后转入PDB黄芩苷培养液复筛,高效液相色谱法定性及定量分析,得到一株能够高效转化黄芩苷为黄芩素的菌株RM3,该菌在添加0. 1%黄芩苷的PDB培养液中能够将黄芩苷转化为黄芩素,未经任何优化条件下,28℃,150 rpm培养5天后摩尔转化率达到83. 87%。通过对菌落的形态、显微结构观察及ITS序列分析比对,鉴定菌株RM3为青霉菌(Penicillium sp. RM3)。该菌转化黄芩苷生成黄芩素效率高,且清洁环保,可缓解中药资源紧张,满足市场和临床需求,是一株很有前途的黄芩素生产菌。

黄芩内生真菌发酵黄芩苷生成千层纸素A的代谢途径及转化条件研究

本研究采用黄芩内生青霉菌Penicillium sp.R3发酵转化黄芩苷生产千层纸素A,探索生物转化途径,优化发酵转化条件,旨在为天然产物千层纸素A的开发利用提供新方法、新途径。菌株Penicillium sp.R3在马铃薯葡萄糖(PDB)培养液中培养并进行转化反应,菌株生长4天后达到最大生物量,之后进入稳定期。通过不用底物添加法分析其生物转化途径,高效液相色谱检测发现菌株转化黄芩苷生成千层纸素A同时伴随黄芩素产生,且黄芩素为中间产物。单因素分析结合正交试验方法获取发酵转化的最适条件为:摇瓶装液量10%,接种孢子浓度1×106~2×106个/mL,30℃,150 rpm培养3天后添加0.08%黄芩苷转化6天。该条件下转化反应摩尔转化率达到42.44%,发酵液中千层纸素A产量达到177 mg/L,且结果稳定性好。实验明确了菌株生长及转化规律,获得了稳定且转化率较高的发酵转化条件,为千层纸素A的进一步开发利用奠定了基础。

黄芩苷对抑郁模型小鼠抑郁行为及海马ERK/CREB蛋白表达的影响

目的探讨黄芩苷(baicalin,BA)对慢性不可预知温和刺激(chronic unpredictable mild stimulus,CUMS)模型小鼠抑郁行为及细胞外调节蛋白激酶(extracellular regulated protein kinase,ERK)、环磷腺苷效应元件结合蛋白(cAMP-response element binding protein,CREB)的调节作用。方法30只癌症研究所(institute of cancer research,ICR)小鼠根据随机数字表法分为对照组(CON组)、模型组(CUMS组)、氟西汀组(FLU组)、黄芩苷高剂量组(BA-H组)、黄芩苷低剂量组(BA-L组),每组6只。除对照组外,运用CUMS方法对其余四组小鼠造模,造模共进行42 d,并从第21天开始按照分组进行灌胃至造模完成。给药结束后运用糖水偏爱实验和水迷宫实验测定小鼠的抑郁样行为,运用蛋白质印迹法(Western blot,WB)和反转录聚合酶链式反应(reverse transcription-polymerase chain reaction,RT-PCR)法分别检测小鼠海马组织中ERK、CREB mRNA和蛋白的表达情况。运用SPSS 21.0软件包,经正态检验和方差齐性检验后,多组间比较采用单因素方差分析(one-way ANOVA),两两比较采用Tukey法。结果糖水偏爱实验显示,与CON组相比,CUMS组的糖水偏爱率降低[(82.88±2.00)%,(64.49±1.24)%;t=19.11,P<0.05]。与CUMS组相比,FLU组[(81.90±1.19)%]、BA-H组[(77.86±2.51)%]、BA-L组[(67.98±2.56)%]小鼠的糖水偏爱率均增加(t=24.83,11.68,3.00;均P<0.05)。水迷宫实验结果显示,与CON组比较,CUMS组小鼠的穿越平台次数[(6.33±0.82)次,(1.83±0.75)次;t=9.93,P<0.05]和目标象限停留时间[(46.83±4.78)s,(24.25±6.12)s;t=7.13,P<0.05]均降低,逃避潜伏期延长[(14.88±3.00)s,(70.70±4.77)s;t=24.26,P<0.05]。与CUMS组相比,FLU组、BA-H组、BA-L组小鼠的穿越平台次数均增加[(5.00±0.89)次,(5.17±0.75)次,(3.33±0.82)次;t=6.64,7.67,3.31;均P<0.05],目标象限停留时间均增加[(36.80±2.66)s,(36.82±5.62)s,(33.28±3.56)s;t=4.61,3.71,3.13,均P<0.05],逃避潜伏期时间均缩短[(23.37±4.86)s,(34.83±4.72)s,(62.15±5.30)s;t=17.02,13.10,2.94;均P<0.05]。Weston blot结果显示,与CON组相比,CUMS组小鼠海马的ERK蛋白表达[(1.00±0.15),(0.36±0.10);t=6.26,P<0.05]和CREB蛋白表达[(1.00±0.12)(0.29±0.03);t=10.32,P<0.05]均降低。与CUMS组相比,FLU组、BA-H组、BA-L组小鼠海马的ERK蛋白表达均增加[(0.87±0.05)、(0.77±0.08)、(0.67±0.03);t=8.25,5.79,5.39;均P<0.05],CREB蛋白表达均增加[(0.90±0.12)、(0.84±0.14)、(0.62±0.04);t=8.94,6.59,12.25,均P<0.05]。PCR结果显示,与CON组相比,CUMS组小鼠海马的ERK mRNA[(1.00±0.03),(0.41±0.10);t=9.78,P<0.05]和CREB mRNA[(1.00±0.08)(0.61±0.12);t=4.62,P<0.05]均降低。与CUMS组相比,FLU组、BA-H组、BA-L组小鼠海马的ERK mRNA均增加[(0.71±0.08)、(0.69±0.03)、(0.59±0.04);t=4.15,4.65,2.84;均P<0.05],FLU组、BA-H组小鼠的CREB mRNA均增加[(0.87±0.08)、(0.86±0.07);t=3.14,3.19,均P<0.05]。结论BA对CUMS模型小鼠抑郁样行为有改善作用,其作用机制发挥可能与调节ERK、CREB蛋白有关。