一种系统性红斑狼疮抗体检测芯片的制备及初步应用

目的建立一种应用蛋白芯片法检测多种系统性红斑狼疮相关自身抗体的方法 ,并对各个自身抗体的特异性进行统计和评价。方法将多种自身抗体的检测抗原标志物点制在玻片上制成蛋白芯片,应用蛋白芯片分别检测26例系统性红斑狼疮患者与60例健康体检者血清中自身抗体的表达情况,由于多种自身抗体的产生是系统性红斑狼疮的重要特征,检测自身抗体的表达情况可以作为系统性红斑狼疮临床诊断的血清学依据。结果应用本研究建立的蛋白芯片法可以将84.6%的阳性样本检测出来,而单项自身抗体检测最高阳性率仅为61.54%(抗dsDNA抗体)。另外,15种自身抗体中特异性较高的有:抗dsDNA抗体(80.0%)、抗Ro/SSA-52KD抗体(75.0%)、抗P2抗体(75.0%)。结论蛋白芯片法用于多种自身抗体的检测具有高通量、操作简便、特异性高等特点,并且15种自身抗体联合检测有效提高了检测的灵敏度,提示本检测芯片具有良好的临床检测应用前景。

一种用于早期肺癌筛查的新型自身抗体芯片

非典型增生腺瘤(Atypical adenomatous hyperplasia,AAH)和鳞状细胞增生(squamous cell dysplasia,SCD)与肺部恶性损伤的发展有相关性,精确诊断AAH和SCD有助于早期确诊肺癌,同时有助于肺癌高危人群的筛查与早期干预。本项目利用免疫反应原理,将噬菌体展示技术与生物淘洗技术相结合,获得可表达肿瘤相关蛋白的噬菌体特异性文库,并将噬菌体点制在生物芯片上,筛选得到了与肺部损伤相关的特异性蛋白,经测序分析鉴定出多种自身抗体为恶性肿瘤相关蛋白。最终,通过数据分析,建立筛选分类器,制成筛查检测芯片,用于筛查AAH与SCD,评估早期肺癌风险,表现出重要的临床诊断应用前景。

水通道蛋白4抗体检测细胞系的建立及样本检测

利用细胞转染技术构建了水通道蛋白4的表达质粒,并制备成细胞爬片,之后采用间接免疫荧光技术,检测血清及脑脊液样本中抗AQP4抗体的水平。通过对2241例临床样本的检测,本检测方案表现出较高的灵敏度,检测阳性率16.8%,阳性比例符合流行病学资料,且阳性样本的临床符合度较高。以实验数据为基础,讨论了水通道蛋白4抗体在视神经脊髓炎患者临床检测中的重要应用价值。

IL-7联合IL-2对脐血CD4^+CD25^-T细胞体外诱导扩增影响的研究

目的:初步探讨IL-7联合IL-2对脐血CD4+CD25-T细胞体外扩增的促进作用,建立稳定的体外培养扩增脐血CD4+CD25-Tregs的培养体系,比较诱导扩增后的CD4+CD25+Tregs和自然分选的CD4+CD25+Tregs对PBMCs功能活性的影响。方法:采用免疫磁珠分选法分选出脐血CD4+CD25-T细胞和CD4+CD25+T细胞;加入不同浓度的细胞因子IL-7结合适当浓度的IL-2作为诱导剂,分析IL-7体外诱导CD4+CD25-T细胞增殖的有效性及最适浓度。我们利用流式细胞术检测体外扩增后的CD4+CD25-T细胞表型变化;MTS法检测体外诱导扩增的CD4+CD25+Tregs及自然分选的CD4+CD25+Tregs分别对成人外周血中单个核细胞增殖的抑制作用;RT-PCR方法分析体外诱导扩增的CD4+CD25+Tregs及自然分选的CD4+CD25+Tregs FOXP3基因、IL-10基因和TGF-β基因的cDNA表达的变化。结果:经3周体外培养、各组细胞均有明显的扩增。IL-7诱导组的扩增最强。体外抑制试验显示体外扩增的Tregs对成人外周血中单个核细胞有明显的抑制作用,IL-7联合IL-2诱导CD4+CD25-T细胞生成的CD4+CD25+Tregs具有较自然分选的CD4+CD25+Tregs稍弱的免疫抑制功能,其中IL-7浓度为4 ng/ml,IL-2浓度为2 000 U/ml时诱导CD4+CD25-T细胞生成的CD4+CD25+Tregs杀伤活性最强。结论:成功建立了CD4+CD25+Tregs的体外培养体系,联合应用IL-7、大剂量的IL-2和CD3/CD28单抗是体外诱导扩增CD4+CD25-T细胞成为CD4+CD25+Tregs的优选方法,并且扩增倍数高、可持续高表达CD4及CD25细胞表型。

rhG-CSF动员后联合骨髓干细胞移植治疗糖尿病下肢血管病变的临床观察

目的探讨重组人粒细胞集落刺激因子(recombinant human granulocyte colony stimulating factor,rhG-CSF)动员后联合骨髓干细胞移植治疗糖尿病下肢血管病变的有效性和安全性。方法选择30例糖尿病下肢血管病变患者,采用rhG-CSF动员后联合骨髓干细胞对患肢进行治疗,以治疗前作为自身对照;治疗后1～6个月观察患者肢体肤色、皮温、肢体麻木疼痛、间歇性跛行、踝肱指数(ankle brachial index,ABI)及经皮氧分压(transcutaneouspressure of oxygen,TcPO_2)的变化。结果治疗后患者肢体皮肤颜色、皮温、肢体麻木疼痛症状、间歇性跛行及ABI、TcPO_2均较治疗前明显改善,且无相关并发症和不良反应发生。结论 rhG-CSF动员后联合骨髓干细胞移植可有效治疗糖尿病下肢血管病变,此治疗方法安全、有效,能提高患者的生活质量。

制备人工抗原提呈细胞促进NK细胞增殖和抗肿瘤效应的研究

目的制备双表达CD86和4-1BBL的人工抗原提呈细胞,建立在体外大量的扩增具有较高杀伤活性的人NK细胞的有效方法。方法将表达CD86和4-1BBL的慢病毒感染K562细胞,制备成人工抗原提呈细胞(a APC),与人外周血单个核细胞(PBMC)共培养,使NK细胞在体外大量扩增。结果在培养d15天时,细胞数量达到2. 7×1010个,CD3-CD56+细胞纯度达到99. 4%,细胞体外杀伤活性为96. 27±1. 27%;在小鼠肺癌模型中,治疗组比对照组肿瘤体积明显减小。结论成功制备了有效扩增NK细胞的人工抗原提呈细胞(a APC),建立了在体外高效扩增具有较高杀伤活性的NK细胞的有效方法,为肿瘤和慢性感染性疾病的过继细胞免疫治疗奠定了基础。

SPOP蛋白MATH结构域特异性结合寡肽的抗肾癌作用研究

通过体外研究SBC寡肽分子与SPOP(MATH)的结合能力及其对细胞增殖的影响,初步明确SBC寡肽分子对肾癌细胞的抑制效能,为其进一步的药用开发打下坚实基础。利用细胞转染技术将SBC寡肽的编码基因转染进786-O细胞与对照HeK293,根据细胞克隆形成实验及MTT法观察细胞增殖情况。结果表明,转染SBC寡肽基因后,786-O细胞增殖被抑制(P<0.01)SBC寡肽在抑制肾癌细胞的增殖方面可发挥重要作用。

基于通用探针库的实时荧光PCR技术快速检测阳性血培养瓶中的细菌病原体

为从阳性血培养瓶中快速检测8种细菌,选取Roche公司通用探针库的锁核酸探针进行基于实时荧光PCR技术的一组试验。为鉴定菌种根据革兰氏染色的结果,对四组靶向于一个革兰氏阳性菌和一个革兰氏阴性菌的双重实时荧光PCR反应进行优化。检测的灵敏度是1-10CFU(菌落形成单位)/PCR反应混合物。试验的特异性和交叉反应由28个来自于ATCC(美国模式培养物集存库)的参考菌株和77种血培养阴性的标本进行鉴定。在这些试验样品中没有观察到交叉反应,因此证明试验100%的特异性。72种此前鉴定过的临床病毒株通过实时荧光PCR技术进行测试,验证实时荧光PCR试验的精确度和可行性。此外,用实时荧光PCR试验55类阳性血培养样本,通过生化分析评价,50(90.9%)类被鉴定为相同物种。实时荧光PCR与传统的方法有98.2%的一致。实时荧光PCR可以用来作为从阳性血培养中早期检测常见病原体方法的补充。