土壤镰刀菌种群检测的巢式PCR-DGGE方法的建立

本试验比较了4种提取小麦-玉米轮作免耕田土壤DNA的方法,并对巢式PCR反应体系和扩增条件进行了优化,建立了适合检测土壤中镰刀菌多样性的PCR-DGGE体系。结果表明:土壤DNA的质量是影响PCR扩增结果的关键因子,试剂盒Fast DNA SPINfor Soil所提土壤DNA片段接近23 bp,A260/A280比值为1.84,DNA产量为18.1μg/g,更适合进行PCR反应。DNA模板的浓度决定PCR扩增结果,第一轮PCR扩增的DNA模板适宜量为2～5 ng,以第一轮PCR产物的原液为模板进行第二轮PCR扩增,在退火温度为67℃时扩增结果最好。PCR产物在变性范围为45%～60%的丙烯酰胺梯度凝胶中电泳7～8 h,其条带能够完全分离,可以用作土壤中镰刀菌多样性的检测。