猪性控精子纯度实时荧光定量PCR检测方法的建立

研究旨在利用实时荧光定量PCR法检测杜洛克猪性控精子,以期建立一种快速、准确且经济高效的性控精子纯度检测方法。选取位于猪Y染色体上的Y染色体性别决定区(sex-determining region Y,SRY)基因和位于X染色体上的A-激酶锚定蛋白4(A-kinase anchoring protein 4,AKAP4)基因,以猪耳组织样提取的基因组DNA为模板进行PCR扩增验证引物的特异性,利用胶回收试剂盒进行回收并质粒小提,将获得的两种质粒经检测后稀释至相同浓度(20 ng/μL),混合构建含有不同比例SRY和AKAP4基因的质粒模板,用于绘制检测精子纯度所用标准曲线的反应模板。分别使用SRY和AKAP4基因特异引物检测3个混合的X精子(P.x_gro1、P.x_gro2、P.x_gro3)和3个混合的Y精子(P.y_gro1、P.y_gro2、P.y_gro3)的纯度。结果显示,用SRY基因特异性引物检测P.x_gro1、P.x_gro2、P.x_gro3精子的纯度分别为91.44%、91.93%、88.99%,P.y_gro1、P.y_gro2、P.y_gro3精子的纯度分别为89.91%、87.31%、88.71%;用AKAP4基因特异性引物检测P.x_gro1、P.x_gro2、P.x_gro3精子的纯度分别为91.44%、91.93%、88.99%,P.y_gro1、P.y_gro2、P.y_gro3精子的纯度分别为89.91%、87.31%、88.71%;卡方适合性检验结果显示,两次检测结果之间差异不显著,表明使用这种方法进行精子纯度检测所得结果准确。本试验通过实时荧光定量PCR法准确检测了经流式细胞仪分选后的精子的纯度,建立了一种利用实时荧光定量PCR法检测猪精液中X精子和Y精子比例的新方法。