茶黄素调节AMPK/SIRT1/NF-κB信号通路对膝骨关节炎大鼠的治疗作用

目的:探讨茶黄素调节腺苷酸活化蛋白激酶(AMPK)/沉默信息调节因子1(SIRT1)/核因子-κB(NF-κB)信号通路对膝骨关节炎(KOA)大鼠的治疗作用。方法:向63只SD大鼠右膝关节注射50μL的碘乙酸钠(MIA)0.01mg/μL制备KOA大鼠模型,另取13只大鼠仅膝关节注射生理盐水作为空白组,两周后随机从造模和空白组挑选3只大鼠,进行HE染色、Mankin和lequesne MG评分,以鉴定KOA模型是否制备成功。剩余造模成功大鼠随机分为模型组、茶黄素低剂量组(20mg/kg茶黄素)、茶黄素中剂量组(40mg/kg茶黄素)、茶黄素高剂量组(80mg/kg茶黄素)、塞来昔布组(18mg/kg阳性药塞来昔布)、抑制剂组(80mg/kg茶黄素+0.2mg/kg AMPK抑制剂Compound C)。茶黄素低、中、高剂量组以及塞来昔布组灌胃相应剂量药物,空白组和模型组灌胃等体积的蒸馏水,抑制剂组除灌胃相应剂量茶黄素外还需尾静脉注射相应剂量Compound C,每天1次,连续给药4周。在第15天(造模后1天),第29天(给药第14天)和第43天(给药第28天)检测大鼠机械疼痛阈值和大鼠关节宽度;观察大鼠行为学变化,进行lequesne MG评分;HE染色观察软骨组织病理变化并进行Mankin评分;试剂盒测定血清炎症因子(IL-1β、TNF-α和COMP)以及氧化应激标志物(SOD和MDA)水平;Western Blot检测AMPK/SIRT1/NF-κB信号通路相关蛋白表达。结果:与空白组相比,造模大鼠膝关节细胞排列紊乱,表面粗糙,排列不均匀,软骨细胞数量减少,潮痕不明显,并且Mankin和lequesne MG评分显著升高表明KOA大鼠造模成功。与空白组相比,第15天时,模型组、茶黄素低、中、高剂量组、塞来昔布组和抑制剂组大鼠疼痛阈值显著降低,关节宽度显著增加(P<0.05);与空白组相比,模型组大鼠软骨层较薄,大鼠足底肿胀,HE染色不均匀,细胞排列紊乱,表面粗糙,裂隙均匀,排列不均匀,软骨细胞数量减少,潮痕不明显,Mankin和lequesne MG评分、血清IL-1β、TNF-α、COMP和MDA水平以及软骨组织p-NF-κB p65/NF-κB p65水平显著升高(P<0.05),血清SOD水平和软骨组织p-AMPKα/AMPKα、SIRT1表达水平均显著降低(P<0.05);与模型组相比,茶黄素低、中、高剂量组以及塞来昔布组大鼠疼痛阈值显著升高,关节宽度减少,大鼠足底肿胀减轻,软骨表面损伤轻微,染色更均匀,软骨细胞可见,Mankin和lequesne MG评分、血清IL-1β、TNF-α、COMP和MDA水平以及软骨组织p-NF-κB p65/NF-κB p65水平显著降低(P<0.05),血清SOD水平和软骨组织p-AMPKα/AMPKα、SIRT1表达水平均显著升高(P<0.05);AMPK抑制剂减弱了茶黄素对KOA大鼠的治疗作用。结论:茶黄素通过调节AMPK/SIRT1/NF-κB信号通路对KOA大鼠起治疗作用。

HIF-1α通过炎性小体ASC结构域调控膝骨关节炎的分子机制研究

目的探究下调缺氧诱导因子1(hypoxia-inducible factor 1,HIF-1)对膝骨关节炎模型大鼠的干预效果及对炎性小体凋亡相关斑点样蛋白(apoptosis-related dot-like protein ASC,ASC)通路及信号通路磷酸化修饰作用机制。方法将40只SPF级SD大鼠随机分为对照组(n=10)、模型组(n=10)、阳性对照(negative control,NC)组(n=10)和si-HIF-1α组(n=10)。模型组、NC组与si-HIF-1α组建立大鼠膝关节炎模型,NC组和si-HIF-1α组分别尾静脉注射5 nmol NC质粒和si-HIF-1α质粒,对照组和模型组给与等量生理盐水,HE染色对大鼠膝关节进行HE染色分析并进行病理评分,通过酶联免疫吸附测定(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)检测大鼠关节组织白细胞介素1β(interleukin-1β,IL-1β),白细胞介素6(interleukin-6,IL-6),肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)水平,qPCR检测各组大鼠膝关节组织HIF-1α和血管紧张素转化酶(angiotensin converting enzyme,ACE)表达水平,Western blot检测大鼠膝关节组织炎性小体JUN和ASC蛋白表达水平以及信号通路磷酸化水平。结果与对照组相比,模型组、NC组、si-HIF-1α组大鼠膝关节损伤及病理评分均显著高于对照组,si-HIF-1α组显著低于模型组和NC组,ELISA结果表明与对照组相比,模型组、NC组、si-HIF-1α组关节组织IL-1、IL-6、TNF-α显著升高(P<0.01),si-HIF-1α组显著低于模型组和NC组(P<0.01);qPCR结果表明与对照组相比,模型组和NC组JUN和ASC显著上调,si-HIF-1α组显著下调(P<0.01)。Western blot结果表明与对照组相比,模型组和NC组JUN和ASC显著升高,而si-HIF-1α组显著降低,并且其信号通路磷酸化修饰水平显著降低(P<0.01)。结论下调HIF-1α可以抑制膝关节炎模型大鼠组织炎症因子释放,降低组织损伤,发挥骨保护作用,其机制可能与炎性小体ASC结构域的磷酸化修饰调控相关。