基于非靶向代谢组学分析StLAC2和StLAC6差异影响玉米大斑病菌的机制

【背景】漆酶作为多酚氧化酶,在真菌生长发育及次级代谢等多方面发挥重要的作用。玉米大斑病菌(Setosphaeria turcica)基因组中含有多个漆酶基因,其中StLAC2和StLAC6对玉米大斑病菌生长发育及致病性具有差异的影响。【目的】明确StLAC2和StLAC6对玉米大斑病菌的差异作用机制,挖掘差异代谢物,为开发新的杀菌剂及病害防控新策略提供靶点。【方法】利用无缝克隆的方法将StLAC6和pHZ100-GFP质粒连接,构建StLAC6的回补表达载体。利用PEG介导的原生质体转化法,将构建好的载体转入到StLAC6基因缺失突变体的原生质体中,并利用PCR、RT-qPCR和GFP荧光验证,对所获得的阳性转化子进行鉴定,成功构建StLAC6回补菌株,并分析敲除及回补StLAC2和StLAC6对玉米大斑病菌胞内外黑色素合成及抗氧化性的影响。以野生型、StLAC2和StLAC6基因敲除突变体为试验材料,利用非靶向代谢组学分析其差异代谢物,并利用KEGG分析StLAC2和StLAC6差异作用的机制。【结果】StLAC2和StLAC6对病菌菌丝内和分泌到培养基中的黑色素合成具有差异影响,且StLAC2影响病菌的抗氧化性。代谢组分析发现与玉米大斑病菌野生型菌株相比,敲除StLAC2后无论菌丝中或分泌到培养基中的差异代谢物数量更多,KEGG分析发现差异代谢物主要为脂类尤其是磷脂,StLAC2的缺失造成多种黄酮多酚类代谢物下调。而1,8-二羟基萘型黑色素合成途径的中间代谢物小柱孢酮和柱孢酮含量在ΔStLAC2中显著增加,在ΔStLAC6中显著降低。【结论】StLAC2参与黑色素的聚合,StLAC6负调控玉米大斑病菌黑色素合成,StLAC2和StLAC6差异影响玉米大斑病菌中脂类代谢物和黑色素合成途径的中间代谢物,StLAC2缺失造成多种黄酮多酚类代谢物下调,导致抗氧化性降低。

拟轮枝镰孢与玉米籽粒互作的差异基因筛选及代谢通路分析

【目的】拟轮枝镰孢(Fusarium verticillioides)引起的玉米穗腐病是我国玉米产区发生严重的病害之一,论文旨在了解病原菌与玉米籽粒互作过程中的基因表达差异,为揭示病原菌的致病机制和玉米抗病机制提供依据。【方法】对拟轮枝镰孢侵染玉米籽粒0、4、12和72 h的样品进行转录组测序,之后采用生物信息学分析,分别以玉米和拟轮枝镰孢基因组为参考,以|log_(2)FC|≥1,P-adjust<0.05为阈值筛选互作过程中玉米和拟轮枝镰孢的差异表达基因,利用GO和KEGG对其进行功能注释及富集分析。Goatools软件分析植物-病原互作、MAPK途径和植物激素信号转导通路相关差异基因的表达变化,采用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)方法对测序差异基因进行验证。【结果】在互作4、12和72 h后拟轮枝镰孢分别有140、400和1945个基因上调表达,有9、302和1784个基因下调表达;玉米分别有293、692和1426个基因上调表达,320、482和153个基因下调表达。GO和KEGG富集分析显示,侵染早期拟轮枝镰孢在细胞间隙生长,差异基因主要富集在RNA生物合成、细胞壁结构成分、脂肪酸生物合成、蛋白质代谢、碳水化合物代谢、生物过程和代谢过程等通路中。拟轮枝镰孢早期侵染触发了玉米活性氧(ROS)爆发,差异基因主要富集在对活性氧、过氧化氢的反应,几丁质酶、单加氧酶活性,木质素代谢过程等相关通路中。侵染后期拟轮枝镰孢继续在籽粒中定殖及扩展,差异基因主要富集在碳水化合物和细胞壁多糖分解代谢过程、跨膜转运、氧化还原酶活性等功能通路中。玉米主要通过苯丙素、木质素、类黄酮生物合成,MAPK信号通路、植物-病原互作和植物激素信号转导等途径差异基因大量表达响应病原菌侵染。随机选取6个玉米和6个拟轮枝镰孢的差异表达基因进行qRT-PCR分析,基因表达规律与转录组测序结果一致,证实了RNA-seq的准确性。【结论】在病原菌侵染早期,拟轮枝镰孢在细胞间隙生长,触发玉米活性氧爆发,相关通路差异基因表达;侵染中后期,病原菌以淀粉为营养素,继续在籽粒中定殖及扩展,玉米通过苯丙素、木质素及几丁质酶的生物合成等方面的相关基因表达响应拟轮枝镰孢侵染,同时植物-病原互作、MAPK途径和激素信号转导等途径参与抗拟轮枝镰孢侵染。