银杏叶提取物诱导乳腺癌MCF-7细胞线粒体自噬的机制研究

目的探讨银杏叶提取物(EGB)对乳腺癌MCF-7细胞线粒体自噬的作用机制。方法将乳腺癌MCF-7细胞株分为4组,使用质量浓度为40、80、120 mg/L的EGB分别作用于乳腺癌MCF-7细胞株,培养24或48 h,作为EGB低浓度组、EGB中浓度组、EGB高浓度组,另取未干预的乳腺癌MCF-7细胞作为对照组。MTT法测定细胞增殖;流式细胞仪检测细胞凋亡;免疫荧光法测定核孔蛋白(P62)、微管相关蛋白轻链3Ⅱ(LC3Ⅱ)、胱天蛋白酶-3(caspase-3)含量;PCR仪检测多药耐药相关蛋白1(MRP1)、多药耐药基因1(MDR1)及乳腺癌耐药蛋白(BCRP)mRNA水平;蛋白质印迹法检测细胞胞外信号激酶(ERK)、丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)、p-ERK、p-MAPK蛋白表达。结果MTT法测定细胞增殖结果表明,对照组,EGB低、中、高浓度组24 h细胞增殖分别为0.95±0.14、0.65±0.09、0.51±0.07、0.37±0.04,差异有统计学意义(F=43.13,P<0.001);48 h细胞增殖分别为1.32±0.19、0.54±0.08、0.32±0.05、0.15±0.02,差异有统计学意义(F=141.30,P<0.001);与24 h比较,EGB低、中、高浓度组48 h细胞增殖均降低(均P<0.05)。两两比较发现,EGB处理显著降低了MCF-7细胞活力,对照组,EGB低、中、高浓度组24、48 h细胞增殖均依次降低(均P<0.05)。流式细胞术检测发现,对照组,EGB低、中、高浓度组乳腺癌MCF-7细胞凋亡率分别为2.12%±0.23%、9.28%±0.45%、15.17%±1.28%、22.21%±2.32%,差异有统计学意义(F=128.80,P<0.001)。两两比较发现,对照组,EGB低、中、高浓度组细胞凋亡率依次升高(均P<0.05)。免疫荧光法测定结果显示,对照组,EGB低、中、高浓度组乳腺癌MCF-7细胞P62蛋白相对表达量分别为3.34±0.52、2.85±0.47、2.02±0.18、1.08±0.21,差异有统计学意义(F=41.55,P<0.001);LC3Ⅱ蛋白相对表达量分别为0.24±0.05、1.02±0.14、1.47±0.26、1.95±0.21,差异有统计学意义(F=94.82,P<0.001);caspase-3蛋白相对表达量分别为0.25±0.03、0.68±0.21、1.12±0.17、1.65±0.23,差异有统计学意义(F=68.09,P<0.001)。两两比较发现,对照组,EGB低、中、高浓度组LC3Ⅱ、caspase-3蛋白表达量依次升高,而P62蛋白表达量依次降低(均P<0.05)。PCR实验结果显示,对照组,EGB低、中、高浓度组乳腺癌MCF-7细胞MRP1 mRNA水平分别为1.06±0.14、0.83±0.18、0.71±0.11、0.52±0.08,差异有统计学意义(F=17.41,P<0.001);MDR1 mRNA水平分别为1.14±0.17、0.75±0.13、0.60±0.09、0.48±0.06,差异有统计学意义(F=34.40,P<0.001);BCRP mRNA水平分别为1.09±0.11、0.88±0.13、0.69±0.07、0.57±0.05,差异有统计学意义(F=34.13,P<0.001)。两两比较发现,对照组,EGB低、中、高浓度组MRP1、MDR1、BCRP mRNA水平均依次降低(均P<0.05)。蛋白质印迹法检测结果表明,对照组,EGB低、中、高浓度组乳腺癌MCF-7细胞ERK表达分别为2.54±0.38、1.89±0.25、1.55±0.21、1.12±0.16,差异有统计学意义(F=31.18,P<0.001);MAPK表达分别为2.47±0.34、1.96±0.29、1.63±0.27、1.20±0.24,差异有统计学意义(F=20.90,P<0.001);p-ERK表达分别为2.03±0.29、1.74±0.21、1.45±0.11、1.18±0.24,差异有统计学意义(F=16.31,P<0.001);p-MAPK表达分别为2.26±0.47、1.90±0.41、1.61±0.33、1.35±0.16,差异有统计学意义(F=7.01,P=0.002)。两两比较发现,对照组,EGB低、中、高浓度组细胞ERK、MAPK、p-ERK、p-MAPK表达均依次降低(均P<0.05)。结论EGB可抑制乳腺癌MCF-7细胞增殖,促进MCF-7细胞凋亡,降低P62蛋白表达,升高LC3Ⅱ、caspases-3蛋白表达,诱导细胞线粒体自噬。