DKK1在食管癌组织中的表达及其生物学功能

目的:探讨Dikkopf-1(DKK1)对食管癌细胞周期、侵袭能力的影响.方法:采用免疫组织化学的方法检测DKK1在食管癌组织中的表达,并通过免疫荧光对DKK1在细胞中的分布进行定位分析;应用Westernblot检测食管癌组织及其配对的正常食管组织和4株食管癌细胞系中DKK1蛋白表达水平.通过构建过表达DKK1的真核表达载体,将其转染到食管癌EC9706细胞中,观察细胞周期和侵袭能力的改变.结果:免疫组织化学检测食管癌组织中DKK1阳性表达率为83.34%,免疫荧光结果显示DKK1主要呈细颗粒状散在分布于细胞质中.Westernblot检测表明DKK1在食管癌组织中的表达明显高于配对的正常食管组织;在4株食管癌细胞系中均有不同程度的表达.在食管癌细胞系EC9706中过表达DKK1,S期细胞所占比例明显升高(57.25%vs45.87%,P<0.05),在Boyden小室中穿透基底膜的细胞数目也明显增加(252±6.71vs99.18±3.02;252±6.71vs112.33±3.21,均P<0.01).结论:DKK1在食管癌组织中呈高表达,并且在4个食管癌细胞系中均有表达,在EC9706细胞中过表达DKK1后能够促进细胞由G0/G1期向S期转变,同时能够增加细胞的侵袭能力.

微小RNA-181a在人食管癌EC9706细胞中对靶基因PRDM1调控作用的研究

目的:构建微小RNA(microRNA,miR)-181a的真核表达载体和靶基因PRDM1(encoding PR domain containing1,with ZNF domain)的3'非翻译区(3'-untranslated region,3'UTR)荧光素酶报告载体,在人食管癌EC9706细胞中验证miR-181a对靶基因PRDM1的调控作用。方法:根据miR-181a成熟序列在基因组中的位置及其上下游200个碱基序列,以人食管癌KYSE150细胞基因组DNA为模板设计引物,PCR扩增包含miR-181a前体的序列,克隆到线性化的pMD18-T Simple载体中,经BamHⅠ和EcoRⅠ酶切后亚克隆到质粒pCDNA3.1(+)上,对重组质粒进行酶切鉴定和测序分析。通过实时定量PCR法检测人食管癌EC9706细胞转染重组表达载体pCDNA3.1-miR-181a后成熟miR-181a的表达水平。应用生物信息学预测软件对miR-181a的靶基因进行预测,将候选靶基因PRDM1的3'UTR融合到pMIR荧光素酶基因下游,通过双荧光素酶报告基因检测miR-181a对靶基因PRDM13'UTR的调控作用。将pCDNA3.1-miR-181a表达质粒转染到人食管癌EC9706细胞中,蛋白质印迹法检测其对PRDM1蛋白表达的影响。结果:成功构建miR-181a真核表达载体,实时定量PCR验证表明pCDNA3.1-miR-181a在EC9706细胞中能够过表达成熟miR-181a。生物信息学预测PRDM1可能是miR-181a的靶基因之一,于是构建了PRDM1的3'UTR荧光素酶报告载体pMIR-PRDM1,在此基础上对PRDM1的3'UTR"种子区"进行定点突变。双荧光素酶报告基因分析表明,miR-181a能够作用于PRDM1基因的3'UTR。蛋白质印迹法进一步证实,miR-181a能够抑制性调控内源性PRDM1蛋白的表达。结论:MiR-181a作用于PRDM1基因的3'UTR,在转录后水平上调PRDM1蛋白的表达,提示PRDM1是miR-181a直接调控的靶基因。