miR-145-5p调控Survivin通过凋亡通路对食管癌生物学行为的影响

目的:探讨miR-145-5p靶向调控Survivin及凋亡信号通路对食管癌凋亡、侵袭和迁移的影响。方法:采用实时荧光定量聚合酶链反应(RT-qPCR)检测食管癌组织和细胞系中miR-145-5p、Survivin mRNA相对表达量。双荧光素酶报告基因分析验证miR-145-5p和Survivin的靶向调控关系。通过RT-qPCR法测定细胞转染后miR-145-5p和Survivin mRNA的相对表达量。Western blot检测凋亡通路中BCL2、MDM2和Caspase-3蛋白的表达。通过MTT、流式细胞术、划痕愈合实验及Transwell小室实验检测TE-1细胞存活能力、凋亡率、迁移率及侵袭能力。结果:与癌旁组织相比,miR-145-5p在癌组织中表达低,而Survivin表达高(P<0.05)。与正常食管黏膜上皮HEEC细胞相比,食管癌TE-1细胞中miR-145-5p低表达,Survivin高表达(P<0.05)。双荧光素酶报告基因实验证实,miR-145-5p和Survivin间存在靶向调控关系。与未转染和转染miR-145-5p对照物的TE-1细胞相比,转染miR-145-5p模拟物后可显著增加miR-145-5p的表达,抑制Survivin mRNA的表达,同时BCL2和MDM2蛋白的表达下降,Caspase-3表达上升,促进细胞凋亡,抑制了细胞活性、侵袭和迁移能力(P<0.05)。结论:通过miR-145-5p的负向调控,Survivin表达被抑制,凋亡通路被激活,从而促进细胞凋亡,抑制食管癌细胞存活,侵袭和迁移能力。

C646靶向KAT3b通过Survivin乙酰化调控食管癌侵袭和迁移

目的探讨乙酰基转移酶抑制剂C646靶向KAT3b通过Survivin蛋白乙酰化影响食管癌细胞上皮间质转化(epithelial mesenchymal transformation,EMT)、迁移和侵袭的机制。方法体外培养食管癌TE-1细胞,MTT法筛选C646最佳给药浓度;C646处理TE-1细胞为实验组(C646组),DMSO处理TE-1细胞为对照组(DMSO组);实时荧光定量聚合酶链反应(real-time quantitative polymerase chain reaction,RT-qPCR)检测KAT3b mRN表达量;免疫共沉淀法检测Survivin蛋白乙酰化;Western blot法检测KAT3b及EMT相关蛋白表达;MTT法检测细胞存活能力,细胞划痕实验观察迁移能力,Transwell实验检测侵袭能力。结果C646组中KAT3b mRNA和蛋白表达量下降,且Survivin蛋白乙酰化水平下降;C646组中E-cadherin蛋白表达上调,而N-cadherin、Snail和Slug蛋白表达下降。C646组中食管癌TE-1细胞存活、迁移和侵袭能力显著下降。结论C646可能通过下调KAT3b的表达降低Survivin蛋白乙酰化水平,进而抑制食管癌细胞EMT、存活及迁移侵袭能力。

结核分支杆菌分泌蛋白Mtb81在大肠杆菌中的高效表达

目的通过结核分支杆菌Mtb81基因在大肠杆菌中的表达 ,获得大量纯化的重组Mtb81蛋白。方法应用聚合酶链反应 (polymerasechainreaction ,PCR)技术扩增结核分支杆菌H37RvMtb81DNA序列 ;将目的基因与pGEM T连接 ,转入E .coli DH5a大量繁殖后 ,提取质粒DNA ,酶切鉴定、测序 ;构建pET2 4b Mtb81重组质粒 ,然后转化入表达宿主大肠杆菌BL2 1(DE3) ;诱导转化菌株 ,通过SDS PAGE电泳鉴定Mtb81表达水平 ,采用His.band纯化Mtb81蛋白。结果pGEM T/Mtb81内插入序列测序表明与报道的序列相同 ;pET2 4b Mtb81在大肠杆菌BL2 1(DE3)细胞内以包涵体形式存在 ,表达量占菌体总蛋白的 30 %左右 ,相对分子质量约 88ku ;纯化后的Mtb81样品经SDS PAGE和光密度扫描分析表明其纯度为 95 %左右 ,从培养菌中可获得 2 0 0mg/L左右纯化的蛋白。结论pET2 4b Mtb81大肠杆菌工程菌株能高效表达Mtb81蛋白 ,大量纯化的Mtb81为进一步的研究。

结核分支杆菌分泌蛋白Mtb81克隆、表达、纯化及血清学诊断价值的初步研究

目的通过结核分支杆菌Mtb81基因在大肠杆菌中的表达,获得大量纯化的重组Mtb81蛋白。通过Western-blot和ELISA方法评价Mtb81抗原,检测血清中抗结核抗体的灵敏度和特异性,为进行结核病血清学诊断打下基础。方法应用PCR技术扩增结核分支杆菌H37Rv Mtb81DNA序列;构建pET24b-Mtb81重组质粒,然后转化入表达宿主大肠杆菌BL21(DE3);通过Western-blot鉴定重组Mtb81蛋白,采用Chelating Sepharose Fast Flow纯化重组Mtb81蛋白;将纯化的重组Mtb81蛋白通过Western-blot、酶联免疫吸附试验(ELISA)方法,检测结核病人及正常人血清中的抗体,应用Microsoft Excel软件统计分析实验数据。结果pET24b-Mtb81在大肠杆菌BL21(DE3)细胞内以包涵体形式存在,表达量占菌体总蛋白的30%左右。纯化后的Mtb81样品经SDS-PAGE和光密度扫描分析表明其纯度为95%左右。纯化后的Mtb81蛋白通过Western-blot鉴定,结果显示:加入结核病人血清抗体于目的蛋白位置有一条显色带,而加入正常人血清组则无显色反应;酶联免疫吸附试验(ELISA)方法,检测30例结核病人及正常人血清中的抗体,结果显示:rMtb81的特异性和灵敏度分别为96%、93%。结论pET24b-Mtb81大肠杆菌工程菌株能高效表达Mtb81蛋白,Western-blot结果证明表达蛋白具有很好的免疫反应性和抗原特异性;ELISA结果证明重组Mtb81检测结核病人血清中的抗结核抗体,具有较高的灵敏度和特异性。

Survivin通过Wnt/β-catenin信号通路调控食管癌的侵袭和迁移的机制研究

目的:探讨Survivin在食管癌中的表达及对食管癌细胞中Wnt/β-catenin信号通路、侵袭和迁移的影响。方法:检测人食管癌组织和EC109细胞中Survivin蛋白的表达,并分析其与临床病例特征的相关性。脂质体介导法将Survivin小干扰RNA转染食管癌EC109细胞。基因mRNA相对表达量应用RT-qPCR检测。蛋白的表达应用免疫蛋白印迹(Western blot)检测。细胞存活率、迁移和侵袭能力应用MTT、划痕愈合和Transwell小室实验检测。结果:食管癌组织和EC109细胞中Survivin表达增高。食管癌组织的TNM分期、分化程度和淋巴结转移与Survivin阳性表达相关;RNA干扰下调Survivin后可显著抑制食管癌细胞内Survivin mRNA和蛋白的表达。下调Survivin后,食管癌细胞内wnt3α、β-catenin、cyclinD1和c-myc表达量下降,Wnt/β-catenin信号通路受到抑制,且食管癌细胞的存活、迁移和侵袭能力受到抑制。结论:下调Survivin基因可以通过影响Wnt/β-catenin信号通路而抑制食管癌细胞的存活、迁移和侵袭能力。

乙酰基转移酶KAT3b与ABCE1乙酰化在食管癌中的相关性研究

背景与目的:食管癌是中国癌症死亡的主要原因之一,其发病率和死亡率居高不下。表观遗传学上的乙酰化修饰参与并调控多种肿瘤细胞的增殖、侵袭和转移,乙酰基转移酶参与的肿瘤蛋白的乙酰化修饰可能是食管癌发生的重要机制之一。本研究探讨食管癌中乙酰基转移酶3b(acetyltransferase 3b,KAT3b)的表达及ATP结合盒转运子E1(ATP-combined box transporter E1,ABCE1)蛋白乙酰化水平,分析两者之间的相关性,在食管癌发病过程中的作用及其机制。方法:选取2020年1月—2021年5月承德医学院附属医院胸外科手术切除食管癌标本及癌旁组织各55例。采用免疫组织化学SP法及蛋白质印迹法(Western blot)检测ABCE1和KAT3b蛋白表达,采用免疫共沉淀(coimmunoprecipitation,Co-IP)检测KAT3b蛋白表达和ABCE1蛋白乙酰化水平,采用生物信息学预测KAT3b以ABCE1为底物发生乙酰化的情况,采用荧光免疫组织化学(fluorescence immunohistochemistry,IF)验证ABCE1和KAT3b在癌组织中的定位及表达,分析ABCE1乙酰化与KAT3b的相关性及两者与临床病理学特征的相关性。构建下调KAT3b si-RNA,采用脂质体介导法转染食管癌EC109细胞。采用实时荧光定量聚合酶链反应(real-time fluorescence quantitative polymerase chain reaction,RTFQ-PCR)和Western blot检测KAT3b mRNA表达和蛋白水平,采用Co-IP实验检测细胞内KAT3b表达和ABCE1蛋白乙酰化水平。结果:食管癌组织中ABCE1和KAT3b蛋白表达率显著高于正常食管黏膜(P<0.05);ABCE1蛋白在食管癌组织中发生了乙酰化,且ABCE1蛋白乙酰化率显著高于正常黏膜组织(P<0.05);生物信息学预测乙酰基转移酶KAT3b可以催化ABCE1为底物发生乙酰化,且IF证实ABCE1和KAT3b蛋白在癌组织中同时呈现高表达状态;食管癌组织中ABCE1乙酰化和KAT3b表达具有相关性,两者呈正相关;ABCE1乙酰化及KAT3b与食管癌分期、组织分化及淋巴结转移密切相关,而与性别及年龄无关。体外实验显示,在食管癌细胞内RNA干扰KAT3b后,可抑制KAT3b mRNA和蛋白的表达,同时ABCE1蛋白乙酰化水平也显著下降。结论:在食管癌病变过程中KAT3b与ABCE1乙酰化具有相关性,KAT3b高表达可能是催化ABCE1发生乙酰化的重要上游分子,在食管癌诊治中具有重要的潜在价值。

KAT2A通过Survivin乙酰化抑制Wnt/β-catenin通路调控食管癌的机制

目的探讨食管癌组织中KAT2A与Survivin蛋白乙酰化相关性及下调KAT2A对食管癌细胞Survivin乙酰化、Wnt/β-catenin通路及功能的影响。方法免疫共沉淀实验(Co-IP)检测蛋白乙酰化,免疫组化及Western blot法检测蛋白的表达。生物信息学预测乙酰基转移酶以Survivin为底物发生乙酰化的关系,免疫荧光验证蛋白在癌组织中的定位及表达;构建合成KAT2A小干扰RNA序列,脂质体介导法转染食管癌细胞,qRT-PCR检测mRNA的相对表达量,应用MTT、划痕愈合和Transwell小室实验检测细胞存活率、迁移和侵袭能力。结果免疫组化结果显示,食管癌组织中Survivin蛋白阳性率为71.11%(32/45),高于正常食管黏膜组织的28.89%(13/45);癌组织和正常食管黏膜组织中KAT2A蛋白阳性率分别为75.56%(34/45)和24.44%(11/45),差异有统计学意义(P<0.05)。Western blot结果显示,Survivin在癌组织中表达为(74.35±3.43)%,高于正常食管黏膜组织(22.62±2.48)%;KAT2A在癌组织中表达为(70.68±3.15)%,高于正常食管黏膜组织(23.87±2.67)%,差异有统计学意义(P<0.05)。食管癌组织中Survivin蛋白发生了乙酰化,其乙酰化率为(66.48±3.14)%,高于正常食管黏膜组织的(17.31±2.42)%,差异有统计学意义(P<0.05)。生物信息学预测显示:乙酰基转移酶KAT2A可以催化Survivin为底物发生乙酰化,且免疫荧光证实Survivin和KAT2A蛋白在癌组织中同时呈高表达,两者主要表达于细胞质中,部分表达于细胞核中;食管癌组织中Survivin乙酰化和KAT2A表达呈正相关(r=0.326,P=0.025);体外实验结果显示,KAT2A在食管癌EC109细胞中的阳性率为(87.36±4.24)%,高于正常食管上皮HEEC细胞的(17.45±2.78)%。食管癌EC109细胞内Survivin蛋白乙酰化水平为(87.79±4.12)%,显著高于正常食管上皮HEEC细胞中的(21.28±3.78)%。下调KAT2A后食管癌细胞内Survivin乙酰化水平显著下降,同时wnt3α、β-catenin和c-myc蛋白表达量下降,且抑制了细胞存活、迁移和侵袭能力。结论食管癌病变过程中乙酰基转移酶KAT2A高表达与Survivin蛋白乙酰化修饰具有相关性;KAT2A下调可使Survivin发生去乙酰化,并通过阻断Wnt/β-catenin信号通路影响食管癌细胞的功能。

乙酰基转移酶抑制剂对食管癌细胞KAT5、Survivin乙酰化水平及细胞增殖和迁移的影响

目的探讨乙酰基转移酶抑制剂NU9056对食管癌EC109细胞乙酰基转移酶KAT5、Survivin乙酰化水平及细胞增殖和迁移的影响。方法NU9056处理食管癌EC109细胞为实验组(NU9056组),有机溶剂DMSO处理食管癌EC109细胞为对照组(DMSO组)。采用MTT法筛选并确定NU905最佳给药浓度,RT-qPCR检测KAT5 mRNA表达,Western blot检测KAT5、细胞周期蛋白D1(Cyclin D1)、癌基因-Myc(c-Myc)、B淋巴细胞瘤-2(BCL2)和血管内皮生长因子(VEGF)蛋白表达,免疫共沉淀检测Survivin乙酰化水平,MTT法检测细胞增殖情况,划痕修复实验检测迁移能力,Transwell小室实验检测侵袭能力。结果NU9056可浓度依赖性抑制食管癌EC109细胞增殖,其IC_(50)=0.946μmol/L,确定NU905最佳给药浓度为0.9μmol/L。NU9056组中KAT5 mRNA和蛋白表达较DMSO组明显降低,差异有统计学意义(P<0.05)。NU9056组Survivin乙酰化水平较DMSO组明显下降,差异有统计学意义(P<0.05)。NU9056组肿瘤增殖相关蛋白Cyclin D1、c-Myc、BCL2和VEGF蛋白表达,细胞的增殖能力、侵袭能力、迁移能力较DMSO组明显降低(P<0.05)。结论NU9056可能通过抑制乙酰基转移酶KAT5的表达下调食管癌EC109细胞中Survivin乙酰化水平,进一步抑制肿瘤增殖通路中相关蛋白表达,从而抑制食管癌细胞增殖、侵袭和迁移能力。