河北省圈养貉子隐孢子虫流行现状调查

目的:确定河北省圈养貉子隐孢子虫的流行和虫种/基因亚型分布情况。方法:从河北省多地共采集389份新鲜圈养貉子粪便样品,采用基于隐孢子虫核糖体小亚基rRNA(SSU rRNA)基因的巢式PCR方法进行检测,并对获得的隐孢子虫SSU rRNA基因阳性样本进行隐孢子虫60 kDa糖蛋白(gp 60)基因的扩增,对获得的隐孢子虫SSU rRNA和gp 60基因进行测序和分析,并分别在Mega中构建基于这2个基因的进化树(最大似然法),进一步分析所获隐孢子虫的分子特性。结果:基于隐孢子虫SSU rRNA基因的巢式PCR检测显示,河北省圈养貉子中共检测出6份隐孢子虫阳性样本,隐孢子虫感染率为1.5%(6/389)。其中,6月龄以上貉子的隐孢子虫感染率为1.2%(1/85),6月龄以下貉子的隐孢子虫感染率为1.6%(5/304),二者无显著差异(χ^(2)=0.096,P=0.384)。粪便非正常的貉子隐孢子虫感染率(11.1%,4/36)显著高于粪便正常的貉子(0.6%,2/353)(χ^(2)=23.18,P=0.001)。序列及进化树分析显示,本次从河北省貉子中分离的隐孢子虫虫种均为C.canis,共鉴定出2种基因亚型,即XXa2和XXa4。结论:河北省圈养貉子中存在2种人兽共患的C.canis基因亚型XXa2和XXa4,提示貉子可能成为人隐孢子虫感染的潜在来源。

河北省蛋鸡群ALV p27抗原ELISA检测

禽白血病（Avian Leukusis,AL）是由反转录病毒科禽白血病/肉瘤病毒群病毒引起的禽类多种肿瘤性疾病的总称,可引起感染鸡免疫抑制和多组织器官发育迟缓、萎缩以及肿瘤等,造成鸡的生产性能下降甚至死亡,由鸡分离的ALV划分为A、B、C、D、E、J六个亚群。自2002年蛋鸡群发现禽白血病以来,全国各地频发,特别是自2009年以来,湖北、山东等地鸡白血病疑似病例频发,鸡群ALV的感染率高达60%,病死率高达50%以上[1]。

河北省蛋种鸡场鸡白痢流行情况调查

为了了解河北省蛋种鸡场鸡白痢沙门杆菌的感染情况,2013年8—11月份对河北省唐山、秦皇岛、保定、邢台、邯郸、石家庄6个地区共21个蛋种鸡场鸡白痢的感染状况进行了调查。结果表明：在21个蛋种鸡场中,有2个鸡场不进行鸡白痢的检测,所占比例为9.5%（2/21）;100%检测的仅占23.8%（5/21）;而66.7%（14/21）的种鸡场进行抽检（母鸡抽检5%~20%）。在进行检测的19个鸡场中,检测日龄不尽相同,首次检测日龄在70-140日龄之间,其中在130-140日龄进行首次检测的比例最高,占47.4%（9/19）;19个种鸡场均有鸡白痢感染,其阳性率为0.01%-4.00%。

gltS基因缺失对禽致病性大肠杆菌生物学特性的影响

为研究谷氨酸转运蛋白GltS编码基因对禽致病性大肠杆菌(APEC)生物学特性的影响,本研究利用λ-Red同源重组方法构建APEC CE129(WT)株gltS基因缺失株CE129ΔgltS(KO)和基因回补株CE129ΔgltS/gltS (RS),并均经PCR及测序鉴定,结果显示,gltS基因缺失株及回补株均正确构建。通过连续10 h测定各菌株OD600nm值绘制WT、KO、RS菌株的生长曲线,利用梅里埃自动生化鉴定系统测定3株菌的生化特性;利用K-B纸片法检测3株菌对8类16种药物的敏感性;利用半固体培养基检测3株菌的运动能力。结果显示,3株菌的生长特性、生化特性、药敏特性和运动能力均无明显差异。利用细菌平板计数法计算检测WT与KO菌株的体外竞争指数(CI),分析KO菌株是否致弱。利用结晶紫染色法测定3株菌的生物被膜(BF)的形成能力,并利用刚果红琼脂板及含荧光增白剂的琼脂板分别检测菌株BF中curli菌毛及纤维素的形成情况。结果显示,WT与KO菌株的体外CI为0.32,表明KO菌株轻度致弱。BF形成能力检测结果显示,相对于WT、RS菌株,KO菌株BF的形成能力极显著降低(P<0.001),且KO菌株BF的主要组成成分curli菌毛有明显变化,表明gltS基因参与APEC BF中curli菌毛的形成,而3株菌在含荧光增白剂琼脂板的荧光强度均一致,表明gltS基因与APEC BF中纤维素的形成无关。采用细菌计数法统计WT、KO、RS菌株在6种应激条件下的生存率,结果显示,除氧化应激条件下3株菌的生存率无显著差异外,在酸、碱、热、铁饥饿应激环境中,与WT和RS菌株相比,KO菌株的生存率均极显著降低(P<0.001、P<0.0001)。在50 mg/L、100 mg/L NaNO2中,KO菌株的生存率显著降低(P<0.01);在150 mg/L NaNO2中,KO菌株的生存率极显著降低(P<0.001)。采用菌落计数法测定WT和KO菌株抗不同浓度血清的杀菌作用,结果显示,在高浓度的血清中(50%~100%),WT、KO菌的数量显著高于DH5α对照菌株(P<0.05);但在不同浓度血清中KO菌的数量与WT菌的数量差异不显著。本研究结果首次证实gltS基因参与APEC部分生物学特性的形成,为进一步阐释gltS基因功能及该菌的致病机制奠定了基础。

鸡源绿脓杆菌的分离鉴定及药敏试验

为确诊引起秦皇岛某鸡场细菌性疾病的主要病原菌,分析其耐药情况,为临床用药和治疗提供依据,本试验对送检的病死鸡肝脏中分离得到的4株菌进行形态特征观察、生化鉴定、免疫荧光染色观察、细菌16SrRNA基因PCR扩增与测序分析及药敏试验。结果显示,4株分离菌均为革兰氏阴性、带绿色荧光的短杆菌,PCR扩增出的特异性条带与预期大小相吻合,确定为绿脓杆菌。药敏试验结果显示,分离株对庆大霉素、阿米卡星、大观霉素、头孢他啶、头孢曲松、左氧氟沙星、恩诺沙星、氟苯尼考、多黏菌素B和磷霉素高度敏感,对四环素和强力霉素中度敏感,而对新霉素、头孢噻肟、头孢噻吩、阿莫西林、氨苄西林、红霉素、复方新诺明和磺胺甲氧异唑耐药。提示,该分离菌对常用抗生素耐药情况严重,养殖场应根据药敏试验结果选择敏感药物进行合理用药。

E.tenella河北株EtMIC-2基因克隆及生物信息分析

利用RT-PCR技术扩增出柔嫩艾美耳球虫（E.tenella）河北株EtMIC-2基因,将该基因克隆入pMD19-T载体,进行测序、序列分析与蛋白结构预测。测序显示该基因全长为1 029bp,含有1个1 029bp开放阅读框（ORF）,编码342个氨基酸。该基因与E.tenella杂交株（ZJ）、北京株（BJ）、广东株（GD）、豪顿株（HD）、GenBank上发表的EtMIC-2基因以及布氏艾美耳球虫的MIC-2基因核苷酸序列同源性分别为99.1%、99.7%、99.6%、99.6%、99.8%和40.6%;与其基因编码的氨基酸序列同源性分别为97.7%、99.1%、98.8%、99.1%、99.4%和38.5%。蛋白结构预测显示该蛋白相对分子质量为35 000,理论等电点PI为4.47,包括4 893个原子,分子式C1500H2429N431-O528-S5,丝氨酸（Ser）在20种氨基酸中所占的比例最高,达12.0%,稳定系数为42.19,脂肪系数为77.05;信号肽的位置为前22个氨基酸;空间结构具有17个α螺旋,19个β折叠,15个转角,24处无规则卷曲;只有1个较强疏水位点（大约在第8-11氨基酸处）,没有跨膜区域。

犬细小病毒(CPV-2)的分子生物学特性与进化

对犬细小病毒的分子生物学特点和进化规律进行了综述,阐述了犬细小病毒分子生物学特点和进化两者之间的关系,对我国在犬细小病毒方面的未来研究工作进行了展望。

四种牛病毒性呼吸道病一步法多重PCR方法的建立与应用

牛病毒性呼吸道病(BRD)是一种世界性的并且由多个因素引起的传染病,也是危害我国牛养殖业的主要因素。本研究分别选取保守基因IBRV gB基因、BCoV N基因、BRSV F基因、BPIV3 HN基因,设计特异性引物,建立了IBRV、BCoV、BRSV、BPIV3一步法多重PCR检测方法,并对一步法多重PCR方法反应体系与反应程序进行优化。一步法多重PCR的退火温度、延伸时间、循环数、引物浓度、酶用量分别为60℃、30 s、30次、0.6μmol/L、1.6μL。该方法对IBRV、BRSV、BCoV、BPIV3的最低检测限分别为3.72×10^(-3)、3.14×10^(-6)、2.86×10^(-4)、2.92×10^(-6)ng/μL。利用所建立的一步法多重PCR方法对临床90份样品进行检测,与经典单重PCR检测方法相比,阳性符合率为100%。

从死胎流产的母貉体内检出1株犬链球菌

为确定引起母貉死胎、流产的病原,采集流产仔貉脏器,流产母貉阴道分泌物进行病原菌的分离培养、纯培养、形态观察、致病性试验确定分离菌株为致病菌。并采用ATB全自动生化鉴定系统进行生化鉴定,鉴定该菌为犬链球菌（S.canis）。该菌的16S rRNA基因系统发育树分析结果表明,分离菌与S.canis同源性达94.5%-99.3%。溶血活性结果表明,该病原菌在血平板上呈β型溶血。药敏试验显示,该菌对阿莫西林、氧氟沙星、磷霉素、头孢他啶等药物敏感。

重组质粒pcDNA3-IL-2对鸡球虫疫苗的免疫增效作用

为了确定重组质粒pcDNA3-IL-2对鸡球虫疫苗的免疫增效作用,将60只14日龄雏鸡随机分成5组,分别为对照组、球虫活疫苗免疫组、球虫活疫苗免疫加50、100、150μg/只重组质粒组。分组当天进行鸡球虫病四价活疫苗免疫,1,7d分别肌肉注射重组质粒pcDNA3-IL-2。至21d时,除第1组(对照组)外,每只鸡经口灌服E.tenella卵囊8×104个。对免疫后鸡的生长性能,外周血淋巴细胞转化率,血清IFN-γ、IL-2、IgG含量以及攻虫后的抗球虫指数进行测定。结果表明,pcDNA3-IL-2重组质粒对鸡球虫疫苗免疫增效的适宜剂量为100μg/只,与第2组比较,14、21、28d的外周血淋巴细胞转化率显著提高了26.54%、27.15%和24.19%(P<0.05);血清IFN-γ含量显著提高了8.87%、14.56%和15.18%(P<0.05);血清IL-2和IgG含量分别提高了3.40%、4.09%、3.95%和12.75%、9.73%、9.87%,胸腺、法氏囊与脾脏指数分别提高了4.91%、9.27%和2.46%(P>0.05),ACI指数达180.71,提高了9.24%。

低磷低蛋白日粮添加植酸酶和蛋白酶对肉鸡血清生化指标的影响

为了探讨低有效磷、低蛋白日粮中单独或组合添加植酸酶和蛋白酶对肉鸡血清生化指标的影响,试验采用单因子设计,将168只8日龄罗斯308肉鸡随机分为4组,对照组为标准日粮,1组为添加植酸酶的低磷日粮,2组为添加蛋白酶的低蛋白日粮,3组为添加植酸酶和蛋白酶的低磷、低蛋白日粮,试验期为5周,测定第21,42天血清碱性磷酸酶(ALP)、乳酸脱氢酶(LDH)、谷丙转氨酶(GPT)、谷草转氨酶(GOT)活性和总蛋白(TP)、白蛋白(ALB)、钙(Ca)、磷(P)、尿酸(UA)、肌酐(Cre)、总胆红素(T.Bili)、直接胆红素(D.Bili)含量等指标。结果表明:各组血清ALP、LDH、GPT、GOT活性以及Ca、P、TP、ALB、UA、Cre、D.Bili、T.Bili含量均无显著差异(P>0.05),但1,3组肉鸡21,42天血清P含量分别比对照组增加2.05%、6.15%和4.41%、12.33%,而血清ALP活性分别降低13.83%、9.11%和5.52%、13.99%。

鸡柔嫩艾美耳球虫石家庄多重耐药虫株差异基因的表达

采用Trizol试剂法提取鸡柔嫩艾美耳球虫石家庄多重耐药虫株的总RNA,利用3种锚定引物和20种随机引物进行RT-PCR,产物经变性聚丙烯酰胺凝胶电泳后银染,共回收10条差异条带,进行2次PCR扩增,产物回收后与pMDTM18-T Vector连接转化,再进行斑点杂交试验、序列分析和同源性比较。结果表明,石家庄多重耐药性虫株的mRNA的S116序列与GenBank和Sanger上已发表的柔嫩艾美耳球虫第1段染色体上882bp长的序列同源性达99%,为未知蛋白。这为克隆全长cDNA和探索球虫耐药性产生的分子机理奠定了基础。

昌黎县貉貂大肠杆菌分离鉴定与耐药性检测

为确定致昌黎县5个貉、貂养殖场因腹泻死亡的貉、貂的病原及其耐药性,试验采集死亡貉、貂的病料进行病原分离、染色镜检和生化试验,并对分离菌进行药敏试验。结果表明：分离出的5株菌均为大肠杆菌,3株貉源大肠杆菌的耐药率分别为66.67%（14/21）、57.14%（12/21）和57.14%（12/21）;2株貂源大肠杆菌的耐药率均为61.90%（13/21）。5株大肠杆菌对林可霉素、氨苄西林、阿莫西林、四环素、多西环素、多黏菌素B的耐药性高达100%;对头孢噻肟、头孢噻吩、磺胺甲氧异口恶唑、红霉素的耐药性为80%;对头孢曲松、氟苯尼考的耐药性为60%;对丁胺卡那均高敏;除貉场3分离的大肠杆菌对磷霉素耐药外,其他4株菌均对磷霉素高度敏感。

低磷低蛋白日粮添加植酸酶与蛋白酶对肉鸡营养物质利用率的影响

为了研究在低磷低蛋白日粮中单独或组合添加植酸酶和蛋白酶对肉鸡营养物质利用率的影响，试验将168只8日龄罗斯308肉鸡随机分为4组，对照组饲喂标准日粮，1组饲喂含植酸酶的低磷日粮，2组饲喂含蛋白酶的低蛋白日粮，3组饲喂含植酸酶和蛋白酶的低磷低蛋白日粮，于肉鸡19—21，40—42日龄进行代谢试验，测定粪中粗蛋白、钙、磷含量及其表观利用率。结果表明：与对照组比较，低磷日粮添加植酸酶可使肉鸡磷、钙排泄量分别降低26．91％-39．96％和6．93％～23．83％，磷、钙表观利用率分别提高14．34％～49．96％和7．90％-27．60％。低蛋白日粮添加蛋白酶可使肉鸡蛋白质和钙的排泄量降低4．10％～5．16％和1．57％-11．72％，蛋白质和钙表观利用率分别提高5．27％～6．98％和10．54％-22．73％。低磷低蛋白日粮联合添加植酸酶和蛋白酶，肉鸡蛋白质、磷、钙排泄量分别降低1．99％～7．10％、16．50％～38．36％、4．09％-18．81％，蛋白质、磷、钙表观利用率分别提高3．19％～6．98％、17．20％～59．42％、14．07％-30．28％。

我国种鸡场种鸡鸡白痢感染现状与控制

鸡白痢是一种常见的蛋传性细菌性疾病。为了有效控制该病的发生,笔者在对我国种鸡场种鸡鸡白痢感染现状分析的同时,提出了种鸡检疫、种鸡场生物安全、药物预防、培育抗沙门氏菌新品系等综合防控措施。

罗斯308鸡IL-2基因的克隆及生物信息学分析

为了对罗斯308(Ls308)肉鸡白细胞介素2(IL-2)基因进行生物信息学分析,试验根据GenBank中已登录的鸡IL-2 mRNA基因序列,设计1对特异性引物,采用RT-PCR方法成功克隆Ls308肉鸡的IL-2基因。结果表明:Ls308肉鸡IL-2基因CDS区全长为432 bp,含有1个432 bp开放阅读框(ORF),编码143个氨基酸,该基因序列与Gen Bank中登录的鸡、丝毛鸡、印度肉鸡、来航鸡、野猪、狼、猫、牛、人、羊的IL-2核苷酸序列同源性分别为97.2%、99.8%、98.6%、100%、27.5%、31.7%、27.8%、30.3%、30.3%、30.3%,与其氨基酸序列同源性分别为98.6%、99.3%、97.9%、100%、10.5%、10.5%、9.1%、8.4%、10.5%、8.4%。该蛋白理化性质分析结果表明,该蛋白分子质量为16 429 ku,理论等电点(PI)为5.66,分子式为C728H1178N184O225S10,由20种常见氨基酸组成,其中带负电荷的氨基酸(Asp+Glu)占14.0%,带正电荷的氨基酸(Arg+Lys)占11.9%。该蛋白的半衰期为30 h,不稳定系数为41.70,为不稳定蛋白;该蛋白脂溶性为92.03,平均亲水指数为-0.294,该蛋白为亲水蛋白。信号肽预测结果表明,该蛋白N端有信号肽,信号肽位置为前22个氨基酸,说明其分泌蛋白;跨膜区预测结果表明,该蛋白含有一个跨膜区域,预测其为跨膜蛋白;二级结构中以α螺旋和无规则卷曲为主,延伸链和β转角只是在局部出现;三级结构与二级结构预测结果一致,亚细胞定位显示该蛋白可能主要在细胞膜上发挥作用。

貉源嗜水气单胞菌的分离及其生物学特性鉴定

为鉴定所分离的貉源嗜水气单胞菌（A.hydrophila）生物学特性,本试验从无菌采集的10份病死貉的肝脏、心血、肺脏、脾脏等病料组织中分离到相同的单一病原菌,将其命名为HBA-2。通过细菌的生物特性检验与16SrRNA PCR方法对HBA-2进行鉴定。16Sr RNA基因序列的系统发育树分析结果表明,HBA-2与A.hydrophila参考菌株同源性达100%,HBA-2为貉A.hydrophila。动物回归试验结果表明,HBA-2对貉和小鼠具有很强的致病性。用PCR方法检测HBA-2的4种毒力基因aer、hlyA、epa、act,结果显示,HBA-2携带hlyA、epa2种毒力基因。免疫保护性试验结果显示,HBA-2具有很好的免疫原性。药敏试验结果显示,HBA-2对头孢曲松、恩诺沙星、阿米卡星、氟苯尼考、头孢克肟5种药物高敏,对其他药物具有不同程度的耐药。

狐源绿脓杆菌的分离鉴定及药敏试验

为了鉴定引起狐狸肺炎的病原菌,采用常规鉴定法和16S rRNA PCR方法从肺炎的狐狸肺脏病料组织中进行分离培养与鉴定,确定该菌为绿脓杆菌（Pseudomonas aeruginosa）。该菌的16S rRNA基因的系统发育树分析表明,分离菌与绿脓杆菌同源性达100%。动物致病性试验结果表明该分离菌株有致病性。药敏试验显示分离菌株对头孢曲松、阿米卡星、左氧氟沙星、阿奇霉素等药物敏感。