犬α-干扰素蛋白在不同表达载体中的生物学活性比较

根据GenBank中公布的犬α-干扰素(CaIFN-α)基因核酸序列,去掉信号肽后设计并合成1对引物,引入EcoRⅠ和HindⅢ酶切位点。以提取的犬肝脏DNA为模板,利用PCR技术扩增CaIFN-α基因,并分别克隆至表达载体pBV220、pET-32a(His标签)中,转化大肠杆菌BL21(DE3)原核表达系统。重组融合蛋白经SDS-PAGE及Western blotting鉴定。纯化目的蛋白,并采用MDCK/VSV微量细胞病变抑制法检测其抗病毒活性。试验结果表明,与pBV220载体连接的目的基因表达的蛋白活性较低,而与pET-32a(His标签)连接的目的基因表达的蛋白活性较高,达2.56×106 U/mL。通过分析不同载体对IFN-α的表达情况,为生产高活性的IFN奠定基础。

抗犬细小病毒单链抗体的制备

提取分泌犬细小病毒的杂交瘤细胞株3H9的总RNA,反转录获得c DNA链,并以此为模板扩增重链可变区(VH)基因和轻链可变区(VL)基因,利用SOE PCR方法连接VH基因和VL基因,同时引入(Gly4Ser)3连接肽序列,扩增得到大小为765 bp的单链抗体(Sc Fv)基因。将Sc Fv基因连接至原核表达载体p ET-32a(+),构建成重组质粒p ET-32a-Sc Fv,转化至BL21(DE3)感受态细胞,并在37℃条件下进行IPTG诱导表达,得到融合蛋白。经SDS-PAGE分析大小约为46 ku,与预期结果相符。经Western-blotting鉴定,该蛋白能被抗His标签的单克隆抗体特异性识别。间接ELISA试验以及中和试验结果表明,Sc Fv能够与犬细小病毒结合,具有中和犬细小病毒的活性。本试验成功构建了抗犬细小病毒单链抗体,并获得了高效表达。