稳定感染HPV-16 E6-E7的人喉咽鳞癌FaDu细胞生物学特性观察

目的:观察稳定感染HPV-16 E6-E7对Fa Du细胞生物学行为的影响和调控。方法:全基因合成HPV-16E6-E7基因,将其与慢病毒载体p LV-EGFP-C在T4连接酶作用下连接。制备重组HPV-16 E6-E7慢病毒并感染Fa Du细胞。将细胞分3组:实验组(重组HPV-16 E6-E7慢病毒稳定感染的Fa Du细胞)、载体对照组(慢病毒空载体稳定感染的Fa Du细胞)和空白对照组(未感染慢病毒的Fa Du细胞)。分别用CCK-8试剂盒检测各组细胞增殖情况,流式细胞术检测细胞周期和凋亡情况,Transwell侵袭实验检测细胞的体外侵袭能力。结果:获得稳定感染重组HPV-16 E6-E7慢病毒的Fa Du细胞,荧光显微镜下可见明亮的绿色荧光蛋白EGFP表达。整合HPV-16 E6-E7基因的Fa Du细胞增殖能力和侵袭力均增强,细胞凋亡率降低,S期和G_2/M期细胞增加,G_0/G_1期细胞减少(P<0.05)。结论:成功建立了HPV-16 E6-E7基因整合的Fa Du细胞。

敲除DNA聚合酶β基因的人食管癌Eca9706细胞系的建立及其细胞生物学特性分析

目的：建立敲除DNA聚合酶β（ DNA polβ）基因的人食管癌Eca 9706细胞株，观察基因敲除细胞生物学行为的变化。方法：采用同源重组基因敲除方法，首先构建食管癌Eca9706细胞DNA polβ基因敲除载体，并将其导入Eca9706细胞，构建DNA polβ基因敲除细胞株。 PCR、RT-PCR、Western blot法检测DNA polβ基因敲除区段DNA存在及表达情况。流式细胞术和MTT法检测基因敲除细胞的细胞周期和生长速度。结果：筛选得到具有neo抗性的DNA polβ基因敲除Eca9706细胞，其基因组中DNA polβ基因区段已被敲除；RT-PCR和Western blot 检测不到DNA polβmRNA和蛋白表达。敲除DNA polβ基因的细胞生长速度缓慢，G2～M期细胞增多，S期细胞减少（ t＝3．882、3.869，P均＜0．05）。结论：成功构建了食管癌Eca9706 DNA polβ基因敲除细胞模型。

人铜锌超氧化物歧化酶真核表达载体的构建及在酿酒酵母中的分泌表达

目的:探讨酿酒酵母中人铜锌超氧化物歧化酶(hCu/Zn-SOD)的分泌表达。方法:采用RT-PCR技术从人胃总RNA中分离扩增hCu/Zn-SOD的cDNA,与酿酒酵母交配因子(MF)α信号肽编码序列融合,将融合基因插入大肠杆菌-酵母细胞穿梭型质粒pYES2.0,构建真核分泌表达质粒pYES-MS,将其转化入酿酒酵母的缺陷型菌株INVSc1中,用半乳糖进行诱导表达,采用SDS-PAGE、蛋白质免疫印迹分析及电泳谱活性染色测定表达产物分泌情况及其活性。结果:该工程菌可高效表达一相对分子质量约为21000的蛋白并与兔抗人Cu/Zn-SOD多抗有特异的免疫反应,同时在培养基上清中检测到此表达蛋白的分泌,具有特异性SOD酶活性。结论:作者成功构建了pY-ES-MS/INV菌株,该菌株大量表达有天然酶活性的hCu/Zn-SOD,并有部分hCu/Zn-SOD分泌到酵母细胞外,为开发hCu/Zn-SOD的基因工程产品奠定了良好的基础。

感染人乳头状瘤病毒的人喉咽鳞癌FaDu细胞系的建立

目的建立稳定感染人乳头状瘤病毒(HPV)阳性的人喉咽鳞癌FaDu细胞系,为体外研究下咽鳞癌提供理想的实验模型。方法重组HPV-16 E6-E7慢病毒,并用其感染人喉咽鳞癌FaDu细胞。RT-PCR和Western blot检测慢病毒稳定感染的FaDu细胞E6、E7m RNA和蛋白表达情况。结果获得稳定感染重组HPV-16 E6-E7慢病毒的FaDu细胞。结论成功建立人乳头状瘤病毒感染的人喉咽鳞癌FaDu细胞系。