保肺化纤方调控TGF-β1/smad2/3、Wnt1/β-catenin信号通路对BLM/PM2.5诱导的特发性肺纤维化大鼠肺组织胶原沉积的影响

目的探讨保肺化纤方经转化生长因子(transforming growth factor,TGF)-β1/smad2/3、Wnt1/β-连环蛋白(catenin)信号通路减轻博来霉素(bleomycin,BLM)/PM2.5暴露诱导的特发性肺纤维化(idiopathic pulmonary fibrosis,IPF)大鼠肺组织胶原沉积的作用机制。方法SD大鼠随机分为对照(Control)组、BLM+PM2.5(Model)组、保肺化纤方(BHF)组、吡非尼酮(pirfenidone,PFD)组、XAV-939组、BHF+PFD组、BHF+XAV-939组。采用一次性气管内雾化BLM法制备IPF大鼠模型,大气PM2.5实时浓缩全身暴露和给予相应药物干预。检测大鼠肺功能,观察肺组织病理和胶原沉积;采用免疫组化技术检测肺组织Ⅰ、Ⅳ型胶原(collagen,COL)、TGF-β1、smad2/3、β-catenin蛋白水平;采用qPCR技术检测肺组织TGF-β1、smad2/3、Wnt1、β-catenin mRNA水平。结果与Control组比较,Model组大鼠肺功能显著降低(P<0.01),肺组织可见大量炎症细胞浸润,肺泡壁断裂、增厚,胶原沉积等肺纤维化特征性病理改变,肺组织胶原容积分数(collagen volume fraction,CVF)、COLⅠ、COLⅣ蛋白及TGF-β1、smad2/3、β-catenin基因与蛋白表达均显著升高(P<0.01);与Model组比较,各治疗组均有效改善大鼠肺组织病理改变,显著降低肺组织CVF及COLⅠ、COLⅣ、TGF-β1、smad2/3、β-catenin蛋白表达水平(P<0.05,P<0.01),同时BHF组、BHF+PFD组、BHF+XAV-939组均能显著提高大鼠肺功能(P<0.05,P<0.01),明显下调肺组织TGF-β1、smad2/3、β-catenin基因表达水平(P<0.01);与PFD组比较,BHF+PFD组大鼠肺组织COLⅠ、TGF-β1蛋白及smad2、β-catenin基因表达均显著降低(P<0.05,P<0.01);与XAV-939组比较,BHF+XAV-939组smad3基因表达显著降低(P<0.01)。结论保肺化纤方可改善BLM/PM2.5诱导的IPF大鼠肺组织病理损伤,减少胶原沉积,提高肺功能,改善肺纤维化,其机制可能与下调TGF-β1/smad2/3、Wnt1/β-catenin通路有关。

肺泡上皮细胞条件培养基对血管内皮细胞损伤的影响

目的观察脂多糖(LPS)诱导的肺泡上皮细胞条件培养基对血管内皮细胞炎症反应及细胞损伤的影响,探讨其机制。方法以LPS诱导的Ⅱ型肺泡上皮细胞(A549)条件培养基为刺激物,建立人脐静脉内皮细胞(HUVEC)损伤模型。采用细胞增殖与毒性检测试剂盒(CCK-8)检测0%(空白组)、12.5%、25%、50%、75%、100%不同浓度A549细胞条件培养基培养6、12、24和48 h对HUVEC活性的影响;酶联免疫吸附试验(ELISA)检测A549细胞条件培养基对HUVEC炎症因子〔白细胞介素-6(IL-6)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)〕、血管活性物质〔血管内皮生长因子(VEGF)、内皮素-1(ET-1)〕水平的影响;鬼笔环肽染色法观察A549细胞条件培养基对HUVEC形态的影响;蛋白质免疫印迹试验(Western blotting)检测A549细胞条件培养基对HUVEC蛋白激酶B/核转录因子-κB(AKT/NF-κB)通路相关蛋白表达的影响。结果与空白组相比,12.5%、25%、50%浓度的A549细胞条件培养基作用6、12、24 h对HUVEC活性无影响,作用48 h后HUVEC活性显著降低,故选择12.5%、25%、50%浓度A549细胞条件培养基作用24 h为诱导条件进行后续实验。与空白组比较,12.5%和50%条件培养基组IL-6水平显著升高(ng/L:2?438.95±64.89、3?036.41±96.69比1?736.75±20.99,均P<0.05),12.5%和25%条件培养基组TNF-α水平显著升高(ng/L:174.08±11.09、81.37±8.17比50.03±0.26,均P<0.01),12.5%、25%和50%条件培养基组VEGF、ET-1水平均显著升高〔VEGF(ng/L):173.60±41.44、192.49±12.38、318.89±27.90比66.68±19.65,ET-1(ng/L):54.88±1.37、36.69±0.29、24.07±0.73比10.67±0.25,均P<0.01〕。鬼笔环肽染色结果显示,25%浓度A549细胞条件培养基诱导的HUVEC细胞形态不规则,大小不均匀,排列紊乱,间隙变宽,微丝结构密集且不清晰,细胞膜呈锯齿样;25%条件培养基组鬼笔环肽染色的细胞荧光强度较空白组显著增加(67?205.60±3?430.40比56?272.67±7?650.95,P<0.05)。Western blotting结果显示,与空白组比较,12.5%、25%、50%条件培养基组HUVEC磷酸化NF-κB抑制因子α(p-IκBα)表达显著降低(p-IκBα/IκBα:0.38±0.08、0.67±0.12、0.31±0.07比1.00±0.00,均P<0.01),磷酸化AKT(p-AKT)、VEGF表达显著升高(p-AKT/AKT:1.50±0.18、1.42±0.27、1.61±0.14比1.00±0.00,EGF/GAPDH:1.37±0.10、1.53±0.22、1.40±0.12比1.00±0.00,均P<0.05),25%条件培养基组磷酸化NF-κB p65(p-P65)表达显著升高(p-P65/P65:1.45±0.14比1.00±0.00,P<0.05)。结论 LPS诱导的肺泡上皮细胞条件培养基可通过激活AKT/NF-κB通路诱导内皮细胞损伤。