骨髓间充质干细胞复合仿生骨支架成骨效应的研究

目的构建骨髓间充质干细胞(BMSCs)复合生物支架材料组织工程骨,探讨低温3D打印联合冷冻干燥法制备的三维仿生复合支架材料内BMSCs增殖、分化、成骨特异性基因表达情况。方法利用低温3D打印结合真空冷冻干燥法制备三维支架,提取新西兰大白兔的BMSCs,用倒置显微镜及免疫组化鉴定BMSCs的形态及特征。将第3代BMSCs与支架复合培养,分成1cm支架培养组、2cm支架培养组和空白组。在不同的培养时间分别进行MTT检测及碱性磷酸酶(ALP)水平测定。采用扫描电子显微镜(SEM)及苏木精-伊红(HE)染色检测细胞以及成骨相关基因的表达量。结果密度梯度离心法获取培养的原代BMSCs呈梭形或三角形贴壁生长,细胞形态均一呈梭形,8代内仍有很强的增殖能力。ALP染色和脂肪染色均为阴性,糖原染色和α-醋酸萘酚酯酶染色均为阳性,特异性表面标志物CD44、CD54的免疫组织化学染色阳性。本实验制备的三维复合支架具有良好的均一性,冻干后成白色立方体的多孔结构,HE染色及SEM可见细胞在支架孔壁黏附、增殖、生长良好,呈现伸展状态。在实验早期,复合培养组细胞增殖、ALP水平及成骨相关基因表达量均大于空白组(P<0.05);在实验晚期,2cm支架培养组细胞增殖、ALP水平及成骨相关基因表达水平均高于1cm支架培养组及空白组(P<0.05)。结论通过细胞形态学、细胞组织化学以及特异性表面标志物CD44、CD54的免疫组织化学染色对分离培养的细胞进行鉴定,说明分离培养的细胞具备BMSCs的特性。本实验室制备的丝素/胶原/羟基磷灰石三维多孔支架具有良好的生物相容性与骨诱导性,有利于细胞黏附、增殖,能促进细胞增殖及成骨相关基因的表达,为构建骨组织工程的良好材料。