转录因子NbMYB1R1通过促进活性氧积累抑制病毒侵染

[背景]黄瓜绿斑驳花叶病毒(cucumber green mottle mosaic virus,CGMMV)是我国重要的检疫性植物病毒,严重降低了世界范围内蔬菜以及瓜类的产量。MYB蛋白家族庞大,功能多样,存在于所有真核生物中。大多数MYB作为转录因子控制植物的发育和代谢,并对植物应对生物和非生物胁迫反应起重要的调控作用。前期研究显示CGMMV侵染后可以显著上调寄主转录因子基因NbMYB1R1的表达。[目的]明确NbMYB1R1参与CGMMV侵染的机制,为CGMMV病害防控提供理论依据。[方法]运用MEGA 7.0构建系统进化树,对NbMYB1R1的氨基酸序列进行系统进化分析;通过构建NbMYB1R1的荧光表达载体,转化GV3101农杆菌后浸润本氏烟叶片,激光共聚焦显微镜观察其亚细胞定位;利用qRT-PCR技术分析NbMYB1R1在CGMMV侵染不同时期的转录水平及NbMYB1R1沉默烟草植株中活性氧(reactive oxygen species,ROS)相关基因的转录变化;通过沉默NbMYB1R1及下游调控基因NbAOX1a和NbAOX1b,分析NbMYB1R1及下游调控基因NbAOX1a和NbAOX1b在CGMMV侵染过程中的作用;瞬时过表达NbMYB1R1和NbMYB1R1关键氨基酸突变体,分析NbMYB1R1对CGMMV侵染的影响;使用台盼蓝染色以及DAB染色观察瞬时过表达NbMYB1R1造成的细胞死亡是否与程序性细胞死亡(programmed cell death,PCD)以及ROS的积累有关;运用酵母双杂交技术验证NbMYB1R1是否与CGMMV相关蛋白互作。[结果]系统进化树分析表明,NbMYB1R1属于1R MYB大类并与多种烟草的MYB转录因子同源性极高;亚细胞定位结果显示NbMYB1R1定位于细胞核;在CGMMV侵染的烟草植株中,NbMYB1R1的转录水平对比健康植株有明显变化,在CGMMV侵染8、12 d时NbMYB1R1的转录水平显著上调;在沉默内源基因NbMYB1R1的植株上接种CGMMV,3 d后NbMYB1R1沉默植株系统叶出现斑驳、卷曲症状,而对照植株在3.5 d时才出现症状;同时CGMMV CP mRNA水平和蛋白水平检测结果也表明沉默NbMYB1R1可以有效促进CGMMV的积累;在本氏烟叶片瞬时过表达NbMYB1R1及其突变体3 d时检测CGMMV蛋白水平表达量,结果显示过表达NbMYB1R1可以有效抑制CGMMV的侵染,DNA结合结构域缺失后会减轻NbMYB1R1对CGMMV的抑制;台盼蓝和DAB染色结果表明,在瞬时过表达NbMYB1R1蛋白后导致ROS积累并引起细胞死亡;在沉默内源基因NbMYB1R1的植株叶片上检测ROS相关基因的转录水平,发现交替氧化酶基因AOX1a、AOX1b转录水平显著上调;在沉默内源基因NbAOX1a和NbAOX1b的植株上接种CGMMV,4 d后NbAOX1a和NbAOX1b沉默植株系统叶出现斑驳、卷曲症状,而对照植株在3.5 d时就出现症状;同时CGMMV CP mRNA水平和蛋白水平检测结果也表明沉默NbAOX1a和NbAOX1b可以有效抑制CGMMV的积累;酵母双杂交结果显示NbMYB1R1不与CGMMV编码蛋白直接相互作用。[结论]随着CGMMV侵染,防御相关基因NbMYB1R1表达上调,从而抑制下游基因AOX1a、AOX1b的表达并激活细胞内产生ROS抑制病毒侵染,但NbMYB1R1不是通过与CGMMV病毒蛋白直接互作而产生此作用。由此可见,NbMYB1R1在CGMMV侵染过程中发挥了重要作用。

转录因子NbERF RAP2-1在黄瓜绿斑驳花叶病毒侵染中的功能

【背景】黄瓜绿斑驳花叶病毒(cucumber green mottle mosaic virus,CGMMV)是我国重要的检疫性植物病毒,对蔬菜和瓜类产业造成严重的经济损失。ERF转录因子可以调控植物生物和非生物胁迫,参与植物对多种病害的防御作用。前期研究显示CGMMV侵染后可以显著下调寄主转录因子Nb ERF RAP2-1的表达。【目的】明确ERF转录因子家族成员在CGMMV侵染过程中的作用,为CGMMV病害防治提供理论依据。【方法】运用MEGA7.0构建系统进化树,对基于Nb ERF RAP2-1蛋白的氨基酸序列进行系统进化分析;构建Nb ERF RAP2-1的荧光表达载体,并观察其亚细胞定位;利用q RT-PCR技术分析Nb ERF RAP2-1在CGMMV侵染不同时期的表达量;通过烟草脆裂病毒(tobacco rattle virus,TRV)介导的基因沉默(VIGS)和瞬时过表达Nb ERF RAP2-1分析其在CGMMV侵染过程中的作用。【结果】系统进化树分析表明,Nb ERF RAP2-1与多种烟草的ERF转录因子同源性极高,与拟南芥的ERF转录因子亲缘关系较远;亚细胞定位结果显示Nb ERF RAP2-1定位于细胞核,作为转录因子行驶功能;CGMMV侵染对本氏烟内源基因Nb ERF RAP2-1的转录水平影响结果显示,在CGMMV侵染6、9、12 d时Nb ERF RAP2-1的表达量无明显变化,在CGMMV侵染15和18 d时Nb ERF RAP2-1表达量显著下调;TRV介导的VIGS可以将植物内源基因Nb ERF RAP2-1有效沉默,在沉默的植株系统叶上接种CGMMV,8 d对照植株系统叶出现斑驳、卷曲症状而Nb ERF RAP2-1沉默植株无症状,同时CGMMV RNA水平和蛋白水平检测结果也表明TRV:Nb ERF RAP2-1可以有效抑制CGMMV的积累;同样,分别在本氏烟叶片瞬时过表达Nb ERF RAP2-124、48和72 h时检测CGMMV RNA水平和蛋白水平表达量,结果显示在病毒侵染早期,即复制阶段就抑制CGMMV的表达。【结论】Nb ERF RAP2-1可以有效抑制CGMMV侵染初期病毒复制,即病毒RNA复制阶段;随着CGMMV不断侵染,在CGMMV细胞间运动和系统运动时期,CGMMV识别防御相关基因Nb ERF RAP2-1并抑制该基因的转录;当Nb ERF RAP2-1缺失后可能抑制了下游蛋白的转录或表达,从而抑制病毒侵染后期的积累。由此可见,Nb ERF RAP2-1在CGMMV侵染过程中发挥了重要作用。

烟秆生物质炭热解温度优化及理化性质分析

为了解热解温度对烟秆生物质炭物理和化学特征的影响,将烟秆分别在350、400、450、500、550和600℃条件下热解制备生物质炭,测定烟秆生物质炭的得率、pH值、电导率和比表面积等基本特征,并通过扫描电镜、红外光谱、X射线能谱、X射线衍射和13 C核磁共振等方法分析烟秆生物质炭的成分及结构特征。结果表明：烟秆生物质炭的得率、O含量、H含量和H/C、O/C、（O＋N）/C原子比均随热解温度的提高逐渐降低,而pH值、电导率、比表面积和C含量等指标随热解温度提高逐渐增大;得率和pH值在大于500℃时趋于稳定,比表面积和pH值在450℃时均达最大（8.86m^2/g和9.98）。此外,随着热解温度的提高,烟秆生物质炭表面的含氧官能团明显减少,矿质元素和表面晶体含量逐渐增大。烟秆生物质炭中K、Al、Ca元素含量较高,分别为28.46-35.47、10.74-35.86和13.15-24.95g/kg;生物质炭的稳定性和芳香化程度随热解温度升高而提高,而整体极性逐渐降低。综合分析,在450℃制备的烟秆生物质炭对农业生产和生态环境的预期效果最好。该研究结果可以为烟秆的资源化利用和烟秆生物质炭在农业生产和生态环境方面的推广应用提供理论依据和技术支持。

超声辅助提取蝙蝠蛾拟青霉菌丝体多糖工艺优化及其理化性质

以蝙蝠蛾拟青霉发酵菌丝体干粉为原料,采用超声辅助提取法对其菌丝体多糖(PHMPs)得率进行了优化,通过苯酚-硫酸法、考马斯亮蓝法、间羟联苯法、钼酸铵-分光光度法、傅里叶红外变换光谱(FT-IR)、高效凝胶色谱法(HPGPC)、1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮(PMP)柱前衍生化法对PHMPs中的理化组成、分子量分布和单糖组成进行了分析。结果表明,在最优的提取条件下即提取温度81℃,提取时间36 min,超声功率为297 W,水料比为44 mL/g,PHMPs得率为13.10%±0.22%。理化分析表明PHMPs中性糖、蛋白质、糖醛酸和磷酸基的含量分别为78.48%±2.08%、9.82%±0.09%、3.76%±0.11%、2.23%±0.09%;红外分析表明PHMPs具有多个糖类官能团的特征吸收峰;HPGPC法测得PHMPs主要由分子量为638、575 kDa的两个主峰和分子量分布在5.6~285 kDa范围的多糖组成;单糖组成测试表明PHMPs主要由甘露糖:葡萄糖:半乳糖以摩尔比42.32:27.58:21.14组成,另外还含有分子摩尔比为0.42:2.89:2.25:1.16:2.24的核糖、鼠李糖、葡萄糖醛酸、半乳糖醛酸和阿拉伯糖。

大豆症青相关病毒CP蛋白的抗血清的制备及检测应用

大豆症青相关病毒(soybean stay-green associated virus,SoSGV)是新发现的一种可以引起大豆症青的植物病毒。大豆症青在中国大豆产区广泛发生流行,严重威胁大豆产业的健康发展,因此建立快速有效的SoSGV检测方法对于大豆症青的监测和防控具有重要意义。本研究依据SoSGV外壳蛋白(coat protein,CP)基因的核苷酸序列设计引物,从发病大豆中扩增得到786 bp的目的基因,将其克隆到原核表达载体pET-28a上,获得重组载体pET-28a-CP。在大肠杆菌Rosseta菌株中经过IPTG诱导表达,获得30 kDa的蛋白,与预期SoSGV CP大小一致。以纯化后SoSGV CP蛋白为抗原,免疫小鼠,制备了特异性SoSGV CP抗血清。In-ELISA检测结果表明,血清效价≥3.2×10~4。Western blot分析表明所制备的SoSGV CP抗体可以在SoSGV侵染的烟草叶片和大豆症青发病的大豆叶片中检测到30 kDa的特异性条带。本研究为SoSGV引起的大豆症青的快速检测提供了重要的技术支撑。

3种黄矮病毒多重RT-PCR检测方法的建立及应用

0 引言.小麦黄矮病是我国小麦生产上重要的病毒病,受害小麦感病后植物矮化叶片黄化,一般减产10%~20%左右,严重的可达到50%以上,个别地块甚至可造成绝产。目前国际上已报道的作物黄矮病毒有十多种[1],我国引起小麦黄矮病的主要病原是大麦黄矮病毒(barley yellow dwarf virus, BYDV)PAV和GAV株系[2],其在全国小麦种植区广泛分布。