健康奶牛和乳腺炎奶牛乳汁中微生物组成的特征及差异研究

奶牛乳腺炎的发生与多种病原微生物密切相关,乳汁中菌群特征的分析对建立乳房炎防控体系和提高乳制品质量和安全具有重要意义。本研究通过16S rRNA基因的V3-V4区测序,分析河南省某奶牛场17头健康奶牛和10头乳房炎奶牛乳汁中微生物菌群结构的多样性和丰富度。结果发现,微生物菌群在11个门、24个纲、37个目、82个科和184个属水平上的相对丰度存在显著差异。乳腺炎奶牛乳汁中微生物菌群结构的多样性和丰富度显著低于健康奶牛乳汁,在乳腺炎奶牛乳汁中厚壁菌门、变形菌门、放线菌门的相对丰度较高。乳腺感染后,变形菌门、软壁菌门的丰度显著降低;互养菌门的丰度显著升高。乳腺炎奶牛乳汁中的链球菌科、链球菌属的相对丰度增加,棒状杆菌科、罗尔斯通氏菌属、假单胞菌属的相对丰度下降。优势菌属中有4个嗜冷菌,健康奶牛和乳腺炎奶牛乳汁中的嗜冷菌总丰度分别为19.5%和42.0%。提示乳汁中微生物组成变化可能与奶牛乳腺炎的发生发展有密切联系,该研究为奶牛场乳房炎的防控及原料奶的质量控制提供了理论依据。

HO-1对IPEC-J2细胞氧化损伤的缓解作用

旨在研究HO-1对猪小肠上皮细胞(IPEC-J2)氧化损伤的缓解作用。利用不同浓度H_(2)O_(2)(100、200、300、400、500、600、1000μmol/L)分别处理IPEC-J2细胞6、12、24 h,利用CCK-8法检测细胞活力,确定H_(2)O_(2)处理细胞的浓度。将IPEC-J2细胞分为对照组(CT)、H_(2)O_(2)组、HO-1+H_(2)O_(2)组,每组3个重复。RT-qPCR检测IPEC-J2细胞中IL-1α、IL-6、IL-8、Keap1、Nrf2 mRNA的相对表达丰度;ELISA检测IPEC-J2细胞中丙二醛(MDA)含量、过氧化氢酶(CAT)活性;化学荧光法检测细胞中活性氧(ROS)水平。结果显示,随着H_(2)O_(2)浓度的增加,IPEC-J2细胞活力降低,400μmol/L H_(2)O_(2)处理12 h,600μmol/L H_(2)O_(2)处理6 h或24 h,IPEC-J2细胞活力均降至50%以下。根据细胞活力下降50%的原则,后续选用400μmol/L H_(2)O_(2)处理IPEC-J2细胞12 h。与CT组相比,H_(2)O_(2)组IPEC-J2细胞中的IL-1α(P<0.05)、IL-6(P<0.01)和IL-8(P<0.01)mRNA相对表达丰度增加,细胞中ROS荧光强度增强(P<0.01)和MDA含量(P<0.001)升高。与H_(2)O_(2)组相比,HO-1+H_(2)O_(2)组IPEC-J2细胞中IL-6(P<0.05)、IL-1α(P<0.01)和IL-8(P<0.05)mRNA相对表达丰度降低,细胞中ROS荧光强度减弱(P<0.05)和MDA含量显著下降(P<0.01)。Keap1/Nrf2信号结果显示,H_(2)O_(2)上调Keap1 mRNA表达(P<0.01),下调Nrf2 mRNA表达(P<0.01),降低CAT活性(P<0.01);HO-1与H_(2)O_(2)共处理,IPEC-J2细胞中Keap1 mRNA表达下调(P<0.01),Nrf2 mRNA表达上调(P<0.01),CAT活性升高(P<0.01)。提示400μmol/L H_(2)O_(2)能诱导IPEC-J2细胞发生氧化损伤,HO-1能在一定程度上缓解H_(2)O_(2)诱导IPEC-J2细胞的氧化损伤,HO-1能激活H_(2)O_(2)抑制的Keap1/Nrf2信号,促进抗氧化酶CAT的产生,发挥抑炎、抗氧化作用。

促伪狂犬病毒gD蛋白可溶性表达标签的筛选及融合蛋白生物学活性的检测

为筛选有助于伪狂犬病病毒(PRV)gD蛋白可溶性表达的标签,并检测其融合蛋白的生物学活性,本研究通过PCR扩增PRV gD基因后,分别连接携带MBP、SUMO、NusA和GST 4个不同促溶标签的原核表达载体,构建重组质粒pET21b-MBP-gD、pET21b-SUMO-gD、pET21b-NusA-gD和pET21b-GST-gD。经双酶切和基因测序鉴定正确后分别转化大肠杆菌BL21(DE3),采用IPTG诱导后经SDS-PAGE检测各重组蛋白的表达,筛选可溶性表达效果最好的标签。结果显示,各重组质粒经酶切鉴定均获得852 bp的目的条带与各自的载体条带,均与预期相符,进一步测序结果显示插入基因序列与密码子优化后的PRV gD基因序列一致。SDS-PAGE检测结果显示,MBP标签融合gD蛋白的可溶性表达量最大,GST标签次之,SUMO标签和NusA标签融合的gD蛋白则均以包涵体形式表达。因此,选用重组MBP-gD蛋白(rMBP-gD)做后续鉴定。将rMBP-gD经Ni-NTA柱纯化后采用western blot和间接ELISA检测其反应原性;采用间接免疫荧光试验(IFA)检测该重组蛋白与PK15细胞的结合;将该重组蛋白与PRV-GFP共孵育PK15细胞后,经流式细胞术检测其竞争结合PK15细胞,从而抑制PRV的感染情况。结果显示,rMBP-gD具有反应原性,且可以结合PK15细胞,rMBP-gD蛋白可竞争结合PK15细胞抑制PRV的感染。上述结果首次证实,可溶性原核表达的rMBP-gD表达效果好,且具有生物学活性,本研究为PRV基因工程亚单位疫苗的后续研究奠定了基础。

铜绿假单胞菌噬菌体的分离鉴定和全基因组序列分析

铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)是一种人兽共患的机会性病原体,给养殖业造成巨大经济损失,噬菌体在防治铜绿假单胞菌感染性疾病方面具有应用前景。本试验以实验室保存的铜绿假单胞菌临床分离株PA31为宿主菌,通过点滴法和双层琼脂平板法从水样中分离纯化噬菌体;以PA31和实验室保存的大肠杆菌(Escherichia coli)、沙门菌(Salmonella)、粪肠球菌(Enterococcus faecalis)临床分离株作为宿主菌,通过点滴法分析噬菌体的裂解谱;利用负染法在透射电镜下观察噬菌体形态,双层平板法测定噬菌体的最佳感染复数和一步生长曲线,测定pH和温度对噬菌体稳定性的影响;采用Illumina NovaSeq平台测定噬菌体的全基因组序列,利用A5-MiSeq、SPAdes、GeneMarkS、Rfam、Diamond、BLASTp和MEGA 11.0生物信息软件进行拼接、注释和比较基因组学分析。结果显示,分离出1株铜绿假单胞菌噬菌体vB_PaeM_Ty,其仅能裂解宿主菌PA31和Escherichia coli-39、Enterococcus faecalis-8a,具有一定的宿主特异性;纯化vB_PaeM_Ty效价为1×10^(12)PFU/mL,该噬菌体为肌尾病毒科,最佳感染复数为1.0。一步生长曲线显示,vB_PaeM_Ty感染宿主菌PA31的潜伏期为20 min,裂解期为40 min,裂解量约为142 PFU/mL;在pH 3~12、温度45~70℃范围内噬菌体活性稳定;噬菌体vB_PaeM_Ty的核酸类型为双链DNA(dsDNA),基因组长50051 bp,GC含量为47.23%,编码74个开放阅读框(ORFs);其全基因组比对结果显示,vB_PaeM_Ty与假单胞菌噬菌体K4的同源性最高,基因组序列已经提交GenBank,登录号为OQ555403。结果表明,本试验分离鉴定了1株新的噬菌体vB_PaeM_Ty,其为烈性噬菌体,耐高温环境,且耐酸碱,包含多种功能相关蛋白,提示该噬菌体具有治疗铜绿假单胞菌耐药菌的潜力。

C57BL/6NcGAS基因敲除鼠的构建及对猪伪狂犬病病毒增殖的影响

胞质DNA感受器环鸟苷酸-腺苷酸合成酶(cyclic GMP-AMP synthase,cGAS)能够识别胞质中的双链DNA(double stranded DNA,dsDNA),从而激活Ⅰ型干扰素信号通路抵御外界病原微生物的感染。为研究cGAS基因对猪伪狂犬病病毒(PRV)增殖的影响,本试验首先利用CRISPR/Cas9基因编辑技术构建cGAS基因敲除小鼠,通过H&E染色检测C57BL/6N小鼠和C57BL/6N-cGAS^(-/-)小鼠肺脏和脑组织形态差异及感染PRV后肺脏组织中炎性浸润的影响;Q-PCR检测C57BL/6N小鼠和C57BL/6N-cGAS^(-/-)小鼠感染PRV后对PRV-gB、PRV-TK、IFN-β、ISG15和ISG20基因mRNA表达水平的差异;Western blot及免疫组化检测C57BL/6N小鼠和C57BL/6N-cGAS^(-/-)小鼠感染PRV后PRV-gB和PRV-gE蛋白表达水平;最后利用病毒PFU法检测cGAS敲除鼠对PRV子代病毒滴度的影响。Western blot检测结果显示在C57BL/6N小鼠肺脏和脑组织中cGAS基因敲除成功,同时H&E染色结果显示,cGAS基因敲除对其肺脏和脑组织形态无影响,但感染PRV后C57BL/6N-cGAS^(-/-)小鼠组织中的炎性浸润明显高于C57BL/6N;小鼠存活率试验结果显示,感染PRV后,C57BL/6N-cGAS^(-/-)与C57BL/6N小鼠相比,存活率显著降低。Q-PCR及Western blot检测显示C57BL/6N-cGAS^(-/-)小鼠可以促进PRV-gB和PRV-gE mRNA转录和蛋白表达;PFU测定结果显示,感染PRV后,C57BL/6N-cGAS^(-/-)小鼠体内的病毒滴度显著高于C57BL/6N小鼠。另外,Q-PCR结果显示该基因敲除小鼠可以抑制PRV感染引起的IFN-β、ISG15和ISG20基因mRNA表达上调。以上结果表明cGAS抑制PRV在小鼠体内的增殖。