动物医学制药专业中蛋白纯化教学改革探索

生物制品的质量关系到人类和动物的健康,而蛋白纯化是生物制品的质量保证,因此通过课堂教学、实验操作和考核方式,学生掌握蛋白纯化的基本策略和方法,其目的让学生做到学以致用,为研发单位和企业培养一批应用型人才。

非洲猪瘟病毒增殖过程中主要蛋白研究进展

非洲猪瘟病毒(ASFV)感染猪引起的非洲猪瘟(ASF),是一种急性、烈性、高度接触性传染病,给世界养猪业带来巨大经济损失。ASFV编码超过150种蛋白,广泛参与病毒的进入、复制和形态发生等过程。ASFV主要通过网格蛋白介导的胞吞作用进入宿主细胞,在细胞质中核周微管组织中心(MTOC)处的“病毒工厂”中完成复制和装配,并通过微管转运至细胞膜,以“出芽”的方式释放到细胞外。本文重点分析了参与病毒进入、复制、组装和释放过程的关键蛋白功能,初步探讨其潜在研究价值,为进一步的ASF疫苗和药物靶点研发提供支持。

非洲猪瘟病毒免疫逃逸分子机制研究进展

非洲猪瘟(African swine fever,ASF)是由非洲猪瘟病毒(African swine fever virus,ASFV)感染猪引起的一种急性、烈性、高度接触性传染病,至今没有研发出安全有效的疫苗,一旦暴发会造成重大经济损失。ASFV在和宿主长期作用过程中,通过抑制干扰素和炎症反应,调节凋亡、自噬及细胞免疫等多种途径逃逸机体免疫反应促进自身复制,但具体的机制仍不完全清楚。ASFV复杂的免疫逃逸机制可能是阻碍有效疫苗研发的关键因素之一。借助生物信息学技术对ASFV的基因组和蛋白质组深入分析,筛选病毒的免疫调控关键基因和保护性抗原表位,将在ASFV免疫逃逸分子机制的研究与疫苗研发中发挥重要作用。本文主要对ASFV感染引起的免疫应答反应及可能的免疫逃逸机制研究进行概述,以期为ASF疫苗研制及综合防控提供思路。

非洲猪瘟病毒调控宿主天然免疫应答机制研究进展

非洲猪瘟(African swine fever,ASF)是由非洲猪瘟病毒(African swine fever virus,ASFV)感染引起的高度致死性猪传染病,目前尚无针对该病的有效疫苗和治疗手段。本综述着眼于宿主抗病毒天然免疫应答过程,重点阐述新近发现的ASFV编码蛋白对干扰素(interferon,IFN)信号通路、炎症反应和细胞凋亡过程的调控作用,分析了相关病毒蛋白在ASFV感染、复制和致病力方面的影响,指出了潜在的ASFV新型疫苗研究靶点,以期为临床治疗药物和新型高效疫苗的研发提供方向和思路。

H5N1亚型禽流感病毒HA蛋白在水稻胚乳中的表达及其纯化

为制备H5N1亚型禽流感病毒HA蛋白并评估其免疫原性,利用水稻表达系统表达H5N1亚型禽流感病毒重组HA蛋白。首先构建了重组植物表达载体pCAMBIA1300-HA,该载体具有GT13特有启动子、信号肽SP和终止子,有利于外源基因在水稻中表达。之后将重组质粒pCAMBIA1300-HA通过电转化法导入根癌农杆菌EHA105中,筛选出阳性菌落并侵染水稻愈伤组织。经过暗培养、潮霉素筛选、分化、生根、成苗,采用CTAB法提取水稻叶片DNA,PCR鉴定结果显示,HA基因已插入到水稻基因组中,重组HA基因大小为4660 bp。将阳性植株移植到大田中,4个月后收获水稻种子,提取水稻胚乳蛋白,Western blot鉴定结果表明,HA蛋白在水稻胚乳中成功表达。重组HA蛋白通过Q阴离子层析、疏水层析和凝胶过滤层析三步分离纯化,其纯度达到90%以上。最后将纯化后的重组HA蛋白与ISA 50V佐剂混合并乳化制成疫苗,免疫小鼠,小鼠血清具有较高的特异性抗体水平,表明重组HA蛋白免疫原性较好。综上,成功构建了H5N1亚型禽流感病毒HA重组蛋白的水稻表达系统,并分离纯化获得了高纯度和免疫原性良好的重组HA蛋白。

非洲猪瘟病毒p72蛋白的原核表达及其单克隆抗体的制备

非洲猪瘟病毒(African swine fever virus, ASFV)B646L基因编码的结构蛋白p72是高度保守的抗原,常用作ASFV检测方法的建立。论文将截短的B646L基因连接在pET28b载体,重组质粒命名为pET28b-B646L。将重组质粒转化至大肠埃希氏菌BL21(DE3)感受态细胞,经异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达,纯化p72蛋白并免疫Balb/c小鼠制备单克隆抗体。Western blot和IFA验证结果表明,成功获得1株IgG1亚型的ASFV p72特异性单克隆抗体,可为建立ASFV血清学检测方法提供参考。

非洲猪瘟病毒K205R蛋白特异性纳米抗体的筛选与鉴定

【目的】利用噬菌体展示技术筛选非洲猪瘟病毒(African swine fever virus,ASFV)K205R蛋白的特异性纳米抗体。【方法】将原核表达、纯化的ASFV K205R蛋白免疫双峰驼,采集全血,分离外周血淋巴细胞,提取总RNA并反转录,巢式PCR扩增VHH基因,构建VHH噬菌体文库,利用噬菌体展示技术筛选K205R特异性纳米抗体。【结果】成功构建库容量为5×10^(8)的VHH噬菌体文库,然后利用噬菌体展示技术经过3轮淘选,特异性VHH噬菌体得到明显富集,氨基酸序列比对显示共筛选出5株K205R蛋白的特异性纳米抗体,分别为ASFV-K205R-Nb1、ASFV-K205R-Nb14、ASFV-K205R-Nb35、ASFV-K205R-Nb64和ASFV-K205R-Nb82。【结论】筛选的5株纳米抗体均具有良好的特异性,其中ASFV-K205R-Nb1、ASFV-K205R-Nb35和ASFV-K205R-Nb82具有更好的亲和力,为以纳米抗体作为灵敏探针建立的特异性强、灵敏度高、成本低的新型ASFV血清学诊断方法提供依据。

非洲猪瘟病毒p30蛋白单克隆抗体制备和鉴定

【目的】制备非洲猪瘟病毒(African swine fever virus,ASFV)p30蛋白的单克隆抗体,为非洲猪瘟快速诊断检测方法的建立和疫苗研究提供材料。【方法】构建p30原核表达质粒pET-30a(+)-p30,转化至大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中进行诱导表达,通过镍柱亲和层析获得目的蛋白。p30复性后,每2周对BALB/c小鼠免疫3次,将免疫小鼠的脾脏与骨髓瘤细胞融合制备单克隆抗体,通过ELISA方法和亚克隆筛选分泌抗体的杂交瘤细胞。将筛选出的单克隆细胞注射进小鼠腹腔制备腹水,通过Western blotting检测、免疫荧光测定(IFA)和抗体亚型分析来鉴定单克隆抗体。【结果】试验成功构建了p30蛋白的原核表达质粒,并使用IPTG诱导、纯化获得了原核系统表达的重组p30蛋白;成功制备出4株能稳定分泌针对ASFV p30蛋白的单克隆抗体杂交瘤细胞株,分别命名为:1H3B4、3F2F5、6E3A1和9D6B9。经ELISA测定抗体腹水效价在1∶100000~1∶1000000之间。经Western blotting和IFA鉴定筛选得到的单克隆抗体与p30蛋白能发生特异性反应。经亚型鉴定,3F2F5和9D6B92株单克隆抗体的重链均为IgG2b,轻链均为Kappa;6E3A1株单克隆抗体的重链为IgM,轻链为Kappa;1H3B4株单克隆抗体的重链为IgG2b,轻链为Lambda。【结论】试验成功制备了4株针对ASFV p30蛋白的单克隆抗体,并分析了单克隆抗体的免疫学特性,为p30蛋白的生物学功能研究和ASFV血清学检测提供依据。

非洲猪瘟病毒K205R蛋白的原核表达与单克隆抗体制备

为研发非洲猪瘟病毒的免疫检测试剂提供素材,制备非洲猪瘟病毒K205R蛋白的单克隆抗体。采用PCR方法扩增K205R基因,构建重组表达质粒pET-30a-K205R,将重组质粒pET-30a-K205R转化到大肠埃希氏菌BL21(DE3)中并通过IPTG诱导表达ASFV K205R蛋白。将纯化出的蛋白乳化后免疫小鼠,采用杂交瘤技术制备能稳定分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞。将筛选出来的单克隆细胞注射至小鼠腹腔中,待小鼠腹部膨大时收集腹水,通过ELISA方法鉴定腹水效价、Western blot和IFA鉴定单克隆抗体特异性及反应原性,并对单克隆抗体亚型进行鉴定。经SDS-PAGE鉴定,重组ASFV K205R蛋白成功表达。Western blot分析显示,His标签抗体能够特异性识别重组表达的ASFV K205R蛋白,表明其具有良好的特异性以及反应原性。通过细胞融合和细胞筛选得到1株能稳定分泌抗ASFV K205R蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞,将其命名为1C3G6。ELISA检测腹水中抗体效价为1∶100000。Western blot和IFA鉴定结果显示单克隆抗体1C3G6与K205R蛋白反应性良好。通过亚型鉴定,单克隆抗体1C3G6的重链为IgG2b类,轻链为Kappa型。经Western blot和IFA鉴定,筛选得到的1C3G6单克隆抗体可以特异性识别原核系统和真核系统表达的K205R蛋白,说明该抗体具有良好的特异性。

非洲猪瘟病毒p10蛋白和p49蛋白的生物信息学分析及表位预测

运用多种生物信息技术对非洲猪瘟病毒(ASFV)Georgia 2007/1株p10蛋白和p49蛋白的理化性质、二级及三级空间结构、抗原性、抗原决定簇进行初步分析,并预测其B、T淋巴细胞优势表位。结果表明,p10是亲水性蛋白,含有2个抗原决定簇,该蛋白α-螺旋、β-转角、无规则卷曲和延伸链的比例为32.05%、11.54%、52.56%和3.85%;p49同样是亲水性蛋白,含有17个抗原决定簇,其α-螺旋、β-转角、无规则卷曲和延伸链的比例依次为29.91%、7.53%、55.94%和6.62%。基于以上分析,p10不适合用于ASF疫苗制备的候选蛋白;而p49作为亲水性衣壳蛋白,具有一定免疫原性,有望成为疫苗研制的备选蛋白,为ASFV蛋白研究和疫苗研发提供一定参考。

纳米疫苗在防控非洲猪瘟中的应用前景

现有非洲猪瘟(African swine fever,ASF)疫苗存在免疫原性差、全身不良反应大等缺点,使防疫手段相对局限。近年来,纳米疫苗在增强免疫反应、提高抗原利用率及保证安全性等方面展现出显著优势,因而被广泛研究。目前,在防控ASF中尚未出现有关纳米疫苗的报道。本综述介绍了ASF传统疫苗的研究现状,阐述了纳米疫苗的定义和种类,重点从免疫学角度分析了纳米疫苗在防控ASF的优势,并对纳米疫苗防控ASF研究前景进行了展望,以期为ASF疫苗的研发提供新的思路和方向。

非洲猪瘟新型诊断方法研究进展

非洲猪瘟(African swine fever,ASF)是由非洲猪瘟病毒(African swine fever virus,ASFV)感染猪而引起的一种急性、烈性传染病。2018年,我国发生的ASF疫情对养猪业造成了严重经济损失。目前尚无有效药物和疫苗用于治疗和预防ASF,主要通过临床诊断和扑杀感染动物来控制疫情传播。建立快速、精准和高效的诊断方法对于疫病防控至关重要。综述当前国内外ASF诊断方法的研究进展,重点阐述诊断靶标的选择以及病原学、血清学检测方法的研究现状,为ASF新型诊断方法的研发提供参考。

整合NDV-F基因的重组MDV载体疫苗的构建

为了预防马立克氏病毒(Marek’s disease virus,MDV)和新城疫病毒(Newcastle disease virus,NDV)混合感染给养禽业造成的危害,本研究以细菌人工染色体(BAC)为基因编辑平台,利用Red同源重组技术,将NDV的F基因整合到MDV双基因缺失毒株Md5 BACΔmeqΔLorf9基因组中,诱导Ⅰ-SceⅠ酶表达,将筛选标记卡那霉素抗性基因敲除,构建重组活载体疫苗候选毒株Md5 BACΔmeqΔLorf9-F。PCR以及限制性片段多态性(RFLP)分析结果显示F基因成功整合到MDV基因组且重组质粒基因组完整;将鉴定正确的重组质粒转染鸡胚成纤维细胞,1周后出现明显的细胞病变,且噬斑大小与亲本毒无明显差异;体外生长曲线结果显示,F基因的插入不影响病毒的体外复制能力。结果表明,本研究正确构建了表达NDV保护性抗原F基因的重组MDV,为研制ND重组MDV活载体疫苗奠定了基础,对NDV和MDV混合感染的防控具有重要意义。

奶牛乳房炎病原菌的分离鉴定及15味中药对其抑菌效果试验

为了探究15味中药对奶牛乳房炎主要致病菌的抑制效果,本试验对河南省豫东地区奶牛场采集的160份乳房炎奶样进行病原菌分离鉴定,筛选出主要致病菌,随后用煎煮法提取15味中药的有效成分,并进行浓缩,使用牛津杯法、琼脂稀释法和试管二倍稀释法进行体外抑菌试验,确定15味中药的最小抑菌浓度(MIC)和最小杀菌浓度(MBC)。结果显示,共分离出347株病原菌,其中金黄色葡萄球菌和乳房链球菌检出率较高;15味中药水提物中黄连和紫花地丁对金黄色葡萄球菌抑制作用较强,MIC分别为31.25和62.5 mg/mL,MBC分别为62.5和125 mg/mL;黄连和蒲公英根对乳房链球菌抑制作用较强,MIC均为31.25 mg/mL,MBC分别为31.25和62.5 mg/mL,黄连、蒲公英根、穿心莲和马齿苋对大肠杆菌抑制作用较强,MIC均为62.5 mg/mL,MBC均为125 mg/mL。15味中药水提物中黄连、紫花地丁、蒲公英根、穿心莲和马齿苋对奶牛乳房炎致病菌大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和乳房链球菌的体外抑菌作用较好,提示其可作为潜在的中药抑菌剂。本试验为进一步开发治疗奶牛乳房炎的中药单方或复方制剂提供参考。

非洲猪瘟病毒B602L蛋白的原核表达、纯化及多克隆抗体制备

【目的】非洲猪瘟病毒(African swine fever virus,ASFV)是对生猪养殖业危害极大的一种病原体,B602L蛋白作为其重要的非结构蛋白,是衣壳蛋白p72折叠为正确的三级结构的伴侣分子之一,在病毒组装成二十面体结构的过程中发挥着关键作用。特异性抗体对于抗非洲猪瘟免疫应答机制及血清学检测方法研究具有重要意义,本研究旨在获取ASFV B602L蛋白,并制备抗ASFV B602L蛋白的多克隆抗体,为ASFV B602L蛋白功能研究及相关诊断试剂的研发提供材料。【方法】以ASFV China/2018/AnhuiXCGQ株的B 602 L基因为研究对象,应用生物信息学软件对B602L蛋白的理化性质、信号肽、跨膜结构、抗原性和蛋白结构进行分析后,利用同源重组的方法将其克隆至原核表达载体pET-28a(+)中,转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞后经诱导表达获得B602L重组蛋白,利用镍柱亲和层析进行蛋白纯化,通过SDS-PAGE和Western blotting对B602L蛋白纯化效果进行验证。将纯化后的B602L蛋白免疫BALB/c小鼠制备多克隆抗体,通过间接ELISA方法测定多克隆抗体效价,通过Western blotting和Dot blotting检测多克隆抗体特异性。【结果】生物信息学分析表明,B602L蛋白属于稳定性亲水蛋白,无跨膜区和信号肽。二级结构主要含有α-螺旋(54.91%)、延伸链(9.81%)和无规则卷曲(32.08%)。成功构建了ASFV B602L重组质粒,SDS-PAGE和Western blotting结果显示,重组菌pET-28a-B602L-BL21在16℃、0.5 mmol/L IPTG诱导下高效表达,获得的重组蛋白主要表达在BL21菌株上清中,大小约为70 ku,且能与ASFV阳性血清特异性结合。间接ELISA检测结果显示,制备的抗B602L鼠源多克隆抗体效价达1∶409600,Western blotting和Dot blotting试验结果表明,抗B602L鼠源多克隆抗体能够特异性识别B602L蛋白。【结论】原核表达的B602L重组蛋白具有良好的免疫原性,能够与ASFV阳性血清特异性结合,制备的鼠抗ASFV B602L蛋白多克隆抗体具备较好的生物学活性。本试验结果可为进一步研究ASFV B602L蛋白的生物学功能和非洲猪瘟诊断方法的建立提供生物材料和理论支撑。

非洲猪瘟病毒p72蛋白的原核表达及单克隆抗体的制备

为了研发非洲猪瘟病毒(African swine fever virus, ASFV)的免疫学诊断试剂,试验将ASFV B646L基因克隆至pET-30a(+)载体中构建表达载体pET-30a(+)-p72,利用大肠杆菌表达系统表达重组蛋白,采用SDS-PAGE分析诱导表达的大肠杆菌,以镍柱对重组蛋白进行纯化,通过SDS-PAGE分析和Western-blot鉴定纯化的重组蛋白。用纯化后的重组蛋白免疫Balb/c小鼠,通过细胞融合方法制备杂交瘤细胞。采用间接ELISA方法筛选并检测单克隆抗体,以Western-blot及IFA方法鉴定单克隆抗体的特异性,并通过Mouse Monoclonal Antibody Isotyping ELISA Kit鉴定单克隆抗体的亚型。结果表明:PCR扩增得到大小约为1 941 bp的B646L基因,并成功构建了表达载体pET-30a(+)-p72。诱导表达的大肠杆菌在72 ku处出现目的条带,纯化后的重组蛋白p72在72 ku处出现目的条带。筛选出4种单克隆抗体2C7D8、2E6D12、3B10E3、4G5E6,其效价在1∶100 000~1∶500 000之间,且4种单克隆抗体均能特异性识别真核及原核表达的p72蛋白。4种单克隆抗体的重链亚型均为IgG2b,单克隆抗体2C7D8和4G5E6的轻链亚型为Lambda, 2E6D12和3B10E3的轻链亚型为Kappa。说明利用大肠杆菌表达系统原核表达ASFV重组蛋白p72及制备相应的单克隆抗体是可行的。

水稻表达HA蛋白为探针研制H9亚型禽流感抗体半定量快速检测试纸

建立一种禽流感H9亚型抗体半定量快速检测试纸,用于H9亚型禽流感(AIV)抗体的评价。含HA蛋白水稻粉末用提取液溶解后,离心,取上清,即为HA蛋白粗提液。其经过Q阴离填料和HA单抗亲和纯化,通过SDS-PAGE鉴定,重组HA蛋白纯度达到90%以上。利用胶体金标记纯化HA蛋白为探针,兔抗鸡IgG和HA的多抗分别作为检测线和质控线,依据高致病性禽流感HI诊断技术标准,建立一种适用于监测AIV H9亚型的半定量试纸检测方法。结果表明:胶体金标记HA蛋白量为30 mg/L,兔抗鸡IgG和HA多抗最佳包被质量浓度分别为1.0和1.2 g/L。试纸检测H9N2亚型阳性血清(HI为11 log_(2))的最低检出限是1∶12 800,这相当于HI效价的4 log_(2)。试纸与H5 AIV、新城疫病毒(NDV)、传染性法氏囊病病毒(IBDV)、新城疫病毒(NDV)和马立克病病毒(MDV)阳性血清以及H9亚型阴性血清无交叉反应,在室温下至少能保存6个月,与HI试验平行检测比较,两者的符合率为90.6%。因此本试验研制了一种简单、快速、准确、特异的半定量免疫层析试纸,适用于H9N2亚型抗体临床检测。

非洲猪瘟病毒p54蛋白的截短表达及其单克隆抗体的制备

非洲猪瘟在我国首次暴发至今已经3年多,给我国养猪业及其相关产业带来了严重的损失。本试验主要以非洲猪瘟病毒E183L基因编码的p54蛋白为研究对象,设计扩增截短E183L基因的引物,构建p54蛋白重组表达载体pET-28a(+)-p54,转化至感受态细胞BL21(DE3)中进行诱导表达,获得可溶性表达的重组p54蛋白,通过Ni柱得到良好纯化。之后免疫BALB/c小鼠,将免疫小鼠的脾脏与骨髓瘤细胞融合制备单克隆抗体,通过ELISA方法筛选和3次亚克隆共制备出2株能稳定分泌针对ASFV p54蛋白的单克隆抗体杂交瘤细胞株。经ELISA测定抗体腹水效价在1∶100000~1∶1000000之间。Western blot检测表明单克隆抗体与p54蛋白能够特异性反应。经鉴定2株单克隆抗体亚型均为IgG2b,κ。该研究获得的单克隆抗体将为p54蛋白的生物学功能的研究和ASFV血清学检测奠定基础。

利用细菌人工染色体技术构建整合F基因的重组MDV疫苗株

目的:预防马立克氏病病毒(MDV)和新城疫病毒(NDV)混合感染鸡引起的疾病,构建表达NDV F蛋白的MDV疫苗株CVI988 BAC重组载体,并包装成重组病毒,为疫苗免疫提供更多的重组疫苗选择。方法:首先利用PCR扩增带有卡那霉素(Kanamycin,Kana)抗性基因片段的F基因,采用同源重组的方法将其整合到CVI988 BAC上,进一步诱导I-SceI表达敲除Kana基因而获得重组质粒CVI988 BAC-F。通过磷酸钙法转染鸡胚成纤维细胞获得重组病毒。结果:Western blot和间接免疫荧光实验证实重组病毒能够表达F蛋白。病毒生长曲线和蚀斑大小测定结果表明,F基因的插入不影响病毒的体外增殖。结论:利用BAC技术成功构建了整合F基因的重组MDV病毒CVI988 BAC-F,为MDV重组疫苗研发,防控NDV与MDV共感染奠定了基础。