小麦根腐病菌索氏平脐蠕孢SYBR Green I实时荧光定量PCR检测技术研究

由索氏平脐蠕孢Bipolaris sorokiniana引起的小麦根腐病,常和其他土传真菌病害混合发生,传统的症状鉴别方法很难区分,导致病害防控难度增加。为建立病菌实时荧光定量检测体系,根据ITS序列设计引物,筛选出1对特异性引物BS‐F/R,扩增片段大小为280bp。以菌丝DNA为标准品构建实时荧光定量标准曲线,并对其灵敏度、特异性、可重复性进行评价。结果表明,建立的实时荧光定量PCR检测方法速度快,灵敏度高,特异性强,重复性好。构建的荧光定量PCR标准曲线循环阈值与模板浓度呈良好的线性关系,溶解曲线的吸收峰单一,扩增效率良好。利用该定量检测体系,可以检测出田间小麦样品中52.8fg/μL的病菌DNA。

小麦TaCIPK2基因克隆及与TaCBLs蛋白互作分析

以普通六倍体小麦品种德抗961为材料,根据野大麦HbCIPK2的mRNA序列(GenBank序列号JN831652)设计引物,采用同源克隆方法从小麦中克隆TaCIPK2基因(GenBank序列号KU640381),测序结果显示该基因序列全长1421bp,开放阅读框(ORF)1359bp,编码452个氨基酸残基,预测分子量为50.91kD,pI为9.07。氨基酸序列比对结果表明:该基因与HvCIPK2(KP638475.1)、TaCIPK2(KJ561791.1)、HbCIPK2(JN831652.1)的相似度分别为94.69%、96.93%、95.80%,具有高度同源性;系统进化分析表明它们位于相同进化支上,亲缘关系最近。采用Real-timePCR方法分析不同逆境胁迫处理下TaCIPK2基因表达的特异性,200mmol/LNaCl高盐胁迫处理小麦幼苗后根和叶部TaCIPK2基因均上调表达;4℃低温胁迫处理后根部TaCIPK2基因上调表达,而叶部下调表达;100μmol/LABA胁迫处理后根和叶中TaCIPK2均上调表达。为检测TaCIPK2与TaCBL1、TaCBL2、TaCBL6、TaCBL7的相互作用,构建酵母表达载体pGADT7-TaCIPK2,转化酵母Y187感受态细胞;同理pGBKT7-TaCBL1、pGBKT7-TaCBL2、pGBKT7-TaCBL6、pGBKT7-TaCBL7转化到酵母细胞Y2Hgold中,都没有出现自激活活性和毒性现象。共转化的二倍体酵母,只有pGADT7-TaCIPK2×pGBKT7-TaCBL2和pGBKT7-53×pGADT7-T在SD/-Ade/-His/-Leu/-Trp/X-α-Gal/AbA培养基板上长出的菌落呈现蓝色,说明TaCIPK2能够与TaCBL2相互作用,激活下游报告基因HIS3、AUR1-C、MEL1和ADE2的表达,该研究结果对进一步研究TaCIPK2的功能有一定的指导意义。

TaSPX3基因VIGS沉默表达降低小麦对叶锈病(Puccinia recondite f.sp.tritici)的抗性

为挖掘TaSPX3基因在小麦抗叶锈病中的作用,本研究以前期对叶锈菌感染的小麦转录组数据分析发现的TaSPX3基因受到叶锈菌侵染诱导表达为依据,利用BSMV-VIGS系统沉默中国春和郑麦9023中的TaSPX3基因,利用qRT-PCR技术进一步分析小麦抗病相关基因的转录水平。结果发现TaSPX3基因沉默后,小麦叶锈菌感染加重,降低了小麦对叶锈病的抗性;同时,对侵染过程抗病相关基因转录检测发现,抗病相关基因PR2和CAT的表达水平显著下调。本研究表明TaSPX3基因可能通过调控PR2和CAT基因的表达参与小麦对叶锈病的抗性。